メトホルミンによるインスリン抵抗性誘導ヘパトカインLECT2の発現抑制機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19509
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 高山 浩昭 金沢大学, 医学系, 技術職員 (90725227)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ヘパトカイン / LECT2 / メトホルミン / miRNA

Outline of Annual Research Achievements

メトホルミンによる肝LECT2遺伝子発現抑制について、AMPKまたはPKAのノックダウンがメトホルミンの作用を解除しうるかどうか検討した。その結果、いずれのノックダウンでもメトホルミンの作用を解除することができなかった。またAICARは初代培養肝細胞においてAMPKリン酸化を亢進するもののLECT2遺伝子発現に影響を及ぼさなかった。加えて、フォルスコリンは初代培養肝細胞においてLECT2遺伝子発現に影響を及ぼさず、またLECT2遺伝子発現におけるメトホルミンの作用も解除しなかった。これらの結果はマウス初代培養肝細胞におけるメトホルミンによるLECT2遺伝子発現抑制作用はAMPKまたはPKAの経路とは独立していることを示唆する。
前年度までに、LECT2遺伝子上流5kb以内にメトホルミン応答領域が存在しないことを確かめている。ゲノムデータベースを検索したところ、LECT2遺伝子約15kb上流に予想転写因子結合サイトをリッチに含む種間で保存された領域を発見した。この領域がLECT2遺伝子発現のエンハンサー領域である可能性に注目し、この領域をルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングした。次年度以降にその活性およびこの活性に及ぼすメトホルミンの影響を検討する予定である。
メトホルミンによるLECT2遺伝子発現抑制を経時的に検討したところ、処置後6時間という比較的早い段階から有意に抑制していたことから、メトホルミンがLECT2 mRNAの安定性に影響を及ぼす可能性にも注目した。メトホルミンを処置したマウス初代培養肝細胞におけるmiRNA発現プロファイルを検討した結果、ほとんどすべてのmiRNA発現が抑制されていた。今後はこの結果とLECT2 3'UTRの配列情報とを突き合わせて、LECT2発現を制御しうるmiRNAについて検討を行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初代培養肝細胞を用いた実験では、siRNAによる標的遺伝子のノックダウン効率が毎回異なり、得られた結果の評価に時間がかかってしまった。
当初の想定と異なり、本研究の結果はマウス初代培養肝細胞においてLECT2遺伝子発現の抑制に関してはAMPK、PKAのいずれもメトホルミンの作用経路ではないことを示唆する。今後はその他の作用経路について新たな仮説を立てる必要がある。
LECT2遺伝子の発現制御機構について、上流5kb以内にはメトホルミン応答領域は存在しなかった。最近ではこれまで想定されたよりも遙か上流に遺伝子制御領域が存在していることを示唆する報告もなされているため、LECT2遺伝子についてもさらに上流の領域について検討を行う。

Strategy for Future Research Activity

メトホルミンによるLECT2遺伝子発現抑制作用がプロモーターレベルで起きるのか、それとも転写後のmRNAの安定性によるものなのかを引き続き検討を行う。プロモーター活性については、LECT2遺伝子上流領域に保存されている種間で保存された予想エンハンサー領域の活性に及ぼすメトホルミンの影響を検討する。LECT2 mRNAの安定性については、miRNAチップ解析で絞り込んだmiRNAの作用ならびにメトホルミンがこのmiRNAそのものの発現に及ぼす影響について検討を行う。
今後は研究の遂行スピードを上げるため、単離と培養にコストと時間がかかる初代培養肝細胞だけではなく、cell lineを使用した実験も計画する。

Causes of Carryover

本年度の研究に必要な物品を効率的に購入した結果、156,188円の差額が発生した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の予算と合算し、研究に必要な消耗品の購入に使用する。