2015 Fiscal Year Research-status Report
ヒト赤芽球脱核における収縮環形成位置決定機構の解明
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15K19540
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
鵜生川 久美 秋田大学, 医学部, 助教 (70646554)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ヒト赤芽球 / 脱核 / ダイニン / EHNA（阻害剤） / 微小管形成中心（MTOC） / 細胞極性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）当該年度において、申請者は「赤芽球の脱核における核の細胞極性および収縮環形成は中心体により決定される」との仮説に基づき、中心体に代表される微小管形成中心の合成・機能に関与する分子と中心体と核の挙動、特に核を微小管形成中心（MTOC）側へ動かすモーター蛋白質ダイニンについて解析した。申請者は、正常ヒト後期赤芽球前駆細胞（CFU-E）から成熟赤芽球に至る最終分化段階におけるダイニンの発現と局在を明らかにし、ダイニンのATP分解阻害剤（EHNA）が赤芽球の核偏在化を阻害することで脱核を抑制することを示した。EHNAのダイニン特異性を検証するために、赤芽球の表面マーカーであるCD71、GPAの発現をFACSで解析し、また、GLUT1とGATA1のmRNAレベルを定量PCRで解析した。その結果、EHNAはこれらのマーカー蛋白質の発現に影響しないことを明らかにした。また、EHNAはダイニンの発現自体にも影響（免疫ブロット法）しなかったことから、EHNAのダイニン特異性が示された。本研究中に、マウス赤芽球ではダイニンがTrim58を介したユビキン系により分解されるとの報告がなされたが、ヒト赤芽球では、Trim58の発現を認めたものの（免疫ブロット法による）、脱核までダイニンの発現を確認し、ヒトとマウスでは異なるメカニズムが働いていると考えられた。（EHNA: erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine）
（２）MTOCから伸長する微小管のプラス端集積因子として、NuMA、LGN、4.1Gの発現を免疫ブロット法で確認した。NuMAと4.1Gは赤芽球成熟とともに減少すること、LGNは比較的保たれることを見出した。mDia2（細胞分裂溝形成に関与するアクチン重合分子）は、CFU-Eおよび赤芽球のMTOCへの集積が明らかになり、ダイニン集積との関係が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒト赤芽球の細胞極性決定分子としてダイニンを、阻害剤による機能制御により免疫化学的手法を用いて解析した。本計画推進中に、マウス赤芽球を対象にしたダイニンのユビキチン化による細胞内消化が報告され、また、新奇にTrim58がダイニンの細胞消化の初期蛋白質として同定されたため、ヒト赤芽球系ダイニンの発現（蛋白質レベル）の再検討とTrim58の同定を行ったことがあり、予定していた微小管プラス端集積因子の検討についてはやや遅れているが、今後も引き続き検討していく
これまで、細胞（赤芽球）の性質上、遺伝子導入は困難であることから阻害剤を用いた解析を主体として研究を進めてきたが、蛋白質そのものの発現抑制（あるいは過剰発現）による解析（細胞形態、増殖性、脱核率など）は極めて有効な手段であることを痛感し、その準備（発現ベクターの調製など）を行ったため、当初予定していた研究進行に遅れが生じたこともある。遺伝子導入の方法論確立は喫緊の重要事項であるため、本研究課題とともに同時進行で推進する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）微小管プラス端分子であるNuMA、LGN、4.1Gなどの発現及び細胞内局在の解析を、研究計画に示した手法を用いて推進する。
（２）ダイニン関連分子であるダイナクチン及び細胞分裂溝形成に関わるmDia2とダイニンのMTOC集積との関係を微小管形成中心や細胞骨格蛋白質との関係を解析する。この時、次項（３）で述べる遺伝子レベルでの制御を用いる予定である。
（３）阻害剤による脱核への影響を検討することに加え、siRNAを用いたノックダウンにより機能解析を行う。正常ヒト赤芽球への遺伝子導入を安定して行う方法の確立を目指す。
（４）脱核の際にダイニンが運搬する分子について検討する。抗ダイニン抗体による免疫沈降で得られた蛋白質は、SDS-PAGEで分離後にLC MS/MS（質量分析計）で解析・同定する。新奇蛋白質が同定された場合は、その蛋白質の脱核に関わる機能をノックダウンや阻害剤（現存の場合）を用いて解析する。
遺伝子導入による過剰発現（変異体も含む）によるCFU-Eの増殖性、細胞形態、脱核率について解析する。また、遺伝子導入によるノックダウンが旨く行かない場合は、特異抗体の直接導入を試みる。
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| Causes of Carryover |
物品購入において端数が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
抗体購入に使用予定。
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