2016 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanical dissection of leukemic stem cell generation by using primate ES/iPS cell-derived hematopoietic stem/progenitor cells
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15K19552
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小原 洋志 東京大学, 医科学研究所, 特任講師 (40528733)
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2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | がん遺伝子 / 白血病 / ES細胞 / iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、がん遺伝子（変異型KRAS等）の発現量が未分化造血細胞の細胞周期や自己複製能に与える影響を明らかにするため、以下の実験を実施した。ヒト胚性幹（ES）/人工多能性幹（iPS）細胞のAAV integration site (AAVS1) に対してtet-onシステムを利用したがん遺伝子発現誘導カセットを挿入するゲノム編集を行い、がん遺伝子発現調節ES/iPS細胞を樹立した。ES細胞については、代表的がん抑制遺伝子P53を欠損させたES細胞についても同様のゲノム編集を実施した。全てのゲノム編集細胞は1細胞クローニングを行ったのちにPCR解析により発現誘導カセットが目的の遺伝子座に挿入されていることを確認し、ゲノムシークエンス解析によりトランスジーンに意図しない変異が挿入されていないことを確認した。加えて、レポーター遺伝子としてがん遺伝子とともに挿入した緑色蛍光タンパク質(GFP)が発現誘導可能か検討するとともに、がん遺伝子の発現誘導をウェスタンブロッティング法により検討し、品質に問題がないことを確認した。
得られたゲノム編集iPS細胞について、胚様体形成法により分化誘導を行い、磁気ビーズ細胞分離法によりCD34陽性未分化造血細胞を分離し、がん遺伝子を発現量を制御しつつ誘導し、培養を行った。その結果、P53の欠損あるいはがん遺伝子の発現に応じて細胞周期が亢進する傾向が認められた。引き続き未分化造血細胞の自己複製能について長期培養開始細胞（LTC-IC）アッセイを用いて検討するとともに、免疫不全マウス（NOD/SCID/IL2rgノックアウト（NSG）マウス）への骨髄再構築によるin vivoでの機能評価を準備している。
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