2015 Fiscal Year Research-status Report
miR-155によるT-ALLの薬剤感受性制御機構の解明
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15K19557
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
小山 大輔 自治医科大学, 医学部, 客員研究員 (50741071)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | T-ALL / bortezomib / hsa-miR-155 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
T細胞性急性リンパ性白血病(T-ALL)細胞株にレンチウイルスベクターを使用してSp1を強制発現させたところ、逆説的にSp1タンパク質の発現が低下した。この際、Sp1 mRNAの発現は低下しておらず、Sp1によって誘導されるマイクロRNAによる自己翻訳抑制の可能性が考えられた。そこでmicroRNAが介在している可能性を考え、microRNAアレイを用い、bortezomibによってT-ALL細胞で誘導されるmicroRNAをスクリーニングした。誘導されたmicroRNAの中から、miR-baseなどのデータベースを使用し、主にSp1を標的とするmicroRNAとしてhsa-miR-155を候補として抽出した。さらにリアルタイムPCRでT-ALL細胞における発現量とそのbortezomib投与による変化を調べたところ、bortezomib感受性が高いほどhsa-miR-155のbaselineの発現が高く、より誘導されやすいことが判明した。
また、T-ALL細胞株であるJurkatにおいて、テトラサイクリン誘導発現系ベクターを使用し、ドキシサイクリン存在下にmiR-155を強発現させるシステムを構築した。このシステムを用いてhsa-miR-155を強制発現させると、mockベクターを強制発現させた細胞と比較し、顕著に細胞数が減少してしまう。このシステムを利用して、bortezomibを投与した際の細胞増殖・アポトーシス誘導を定量することを試みたが、hsa-miR-155を強制発現させただけでも細胞死が誘導されてしまうため、評価が困難であった。そこで、CRISPR-Cas9を使用して恒常的にhsa-miR-155の発現を低下させたT-ALL細胞株を樹立した。現在解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
テトラサイクリン発現誘導系を利用したhsa-miR-155を強発現させるシステムを構築したが、それではbortezomibの薬剤感受性等を評価する実験が行えなかった。そこで新たにCRISPR-Cas9を利用し、hsa-miR-155の発現を恒常的に低下させた細胞株を樹立した。
現在その細胞株を用いて解析中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は今回樹立したCRISPR-Cas9によるhsa-miR-155ノックダウン細胞株を使用し、予定通り、bortezomibに対する薬剤感受性の変化、標的遺伝子の検索などを行っていく。
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| Causes of Carryover |
残額が少ないため、物品購入を控えたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
T-ALL細胞株培養に用いる培地や血清など細胞培養関連試薬について約30万円程度を、制限酵素やPCR酵素など分子生物学関連試薬について約40万円程度、ウェスタンブロットやフローサイトメトリー解析に用いる抗体など免疫関連試薬について約40万円程度、マイクロアレイ用試薬に40万円程度と合計で１50万円程度の予算を見込んでおり、平成28年度分の予算とともにすべて使用する計画である。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Phosphorylation-mediated EZH2 Inactivation Promotes Drug Resistance in Multiple Myeloma.2015
Author(s)
Kikuchi, J., Koyama, D., Wada, T., Izumi, T., Hofgaard, P.O., Bogen, B. and Furukawa, Y
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Journal Title
J. Clin. Invest.
Volume: 125
Pages: 4375-4390
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Soluble aKlotho as a Candidate for the Biomarker of Aging.2015
Author(s)
Koyama, D., Sato, Y., Aizawa, M., Maki, T., Kurosawa, M., Kuro-o, M. and Furukawa, Y
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Journal Title
Biochem. Biophys. Res. Commun.
Volume: 467
Pages: 1019-1025
DOI
Peer Reviewed
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