2016 Fiscal Year Research-status Report
臨床応用実現化のためのヒト人工染色体ベクターの構築
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15K19615
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
宇野 愛海 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30733357)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 人工染色体 / 染色体工学 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / 微小核細胞融合法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝子導入効率の低い培養細胞株の改変条件検討として、電気的穿孔法による遺伝子導入法の効率検討する必要があった。例としてA9細胞中でのヒト8番染色体へのCRISPR/Cas9での切断、及び、組み換え効率向上が期待される化合物の効果を検討した。従来法では5%程度の遺伝子導入効率であったが、検討の結果60%程度にまで上昇した。このことから電気穿孔法には遺伝子導入困難細胞にも高効率で遺伝子導入可能であると示された。結果、従来法では改変ヒト8番染色体は作製できなかったが、電気的穿孔法と化合物の組み合わせにより、改変ヒト8番染色体を作製可能であった。今後はこの手法を採用することとした。
また、ヒトX染色体の改変を改変可能な複数同時CRISPR/Cas9発現ベクターを作製した。複数のgRNA発現により、より高効率にヒト一般培養細胞株内、およびiPS細胞内でX染色体に対して切断活性を示すことが可能であった。得られた改変ヒトiPS細胞株について、染色体解析を実施した結果、いずれのクローンでも核型、X染色体ともに正常であることが示されれ、CRISPR/Cas9での切断後も目的通り正常なX染色体が得られると示された。
次に、ヒトX染色体長腕ジストロフィン遺伝子上流に対して、人工テロメア付加により染色体切断を実施するためのCRISPR/Cas9ベクターの作製を行った。5か所の切断候補箇所を設定し、約8-4%の切断活性を示すCRISPR/Cas9ベクターの作製ができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
正常ヒト細胞株よりの染色体導入法については、十分な検討結果が得られていない。
iPS細胞や不死化間葉系幹細胞のみならず、広範なヒト細胞株において染色体導入可能な細胞株の有無を探索する必要があると示唆された。
hiPS細胞中での染色体改変については、当初計画より遅れている。早急に進める必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas9の作製・染色体改変について早急に着手する。
複数種類のヒト細胞株を用いて、微小核細胞融合法が可能か検討する。
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