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2017 Fiscal Year Annual Research Report

Construction of human artificial chromosome towards practical use

Research Project

Project/Area Number 15K19615
Research InstitutionTottori University

Principal Investigator

宇野 愛海  鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30733357)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywordsヒト人工染色体 / 染色体工学 / 微小核細胞融合法 / ゲノム編集
Outline of Annual Research Achievements

臨床用ヒト人工染色体ベクターの構築を目指して、ヒト正常細胞内におけるゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)を用いたヒト人工染色体ベクターの構築を試みた。前年度までの研究期間においてCRISPR/Cas9を用いたCHO細胞内での遺伝子挿入法に加え、テロメア付加による染色体切断法を実証した。またヒトiPS細胞内において、5-7%の切断活性を示すCRISPR/Cas9を作製した。
本年度は、ヒトiPS細胞内でX染色体を切断するためのテロメア付加用ベクターとして、相同組換え配列1kbp、テロメア配列1kbp、陽性選択マーカーPuromysine耐性遺伝子、陰性選択マーカーFcy;;Furを持つベクターを作製した。先のCRISPR/Cas9とこのテロメア付加用ベクターをエレクトロポーレーション法にて、ヒトiPS細胞へと共導入した。Puromysine、及び5-FCを用いて2週間選択培養の後、出現した薬剤耐性クローンの内24クローンを分取し、PCR解析を行った。いずれのクローンもPuromysine耐性遺伝子を保持していた。しかしながら、期待した染色体切断を示す組換えの発生は検出できなかった。また、ヒトiPS細胞を用いてうまくいかない場合の計画として、間葉系幹細胞における7番染色体に対する染色体切断も試みた。しかしながら、同様に24クローンのPuromysine耐性細胞株を得たが、PCR解析の結果ではPuromysine耐性遺伝子は保持していたが、目的通りの組換えを示すクローンは得られなかった。結果として、ヒト細胞内におけるヒト人工染色体ベクターの構築法は確立できていない。

  • Research Products

    (2 results)

All 2017

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results)

  • [Journal Article] CRISPR/Cas9-induced transgene insertion and telomere-associated truncation of a single human chromosome for chromosome engineering in CHO and A9 cells2017

    • Author(s)
      Uno Narumi、Hiramatsu Kei、Uno Katsuhiro、Komoto Shinya、Kazuki Yasuhiro、Oshimura Mitsuo
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 7 Pages: 12739

    • DOI

      10.1038/s41598-017-10418-7

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Combinations of chromosome transfer and genome editing for the development of cell/animal models of human disease and humanized animal models2017

    • Author(s)
      Uno Narumi、Abe Satoshi、Oshimura Mitsuo、Kazuki Yasuhiro
    • Journal Title

      Journal of Human Genetics

      Volume: 63 Pages: 145~156

    • DOI

      10.1038/s10038-017-0378-7

    • Peer Reviewed / Open Access

URL: 

Published: 2018-12-17  

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