CRLF2高発現を示す小児B細胞型急性リンパ球性白血病発症の分子機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19620
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 成戸 卓也 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, プロジェクト助教 (60438124)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: CRLF2

Outline of Annual Research Achievements

急性リンパ性白血病（ALL）は小児がんの約40%を占める。近年の層別化治療により治療成績は大幅に向上した。しかし、約20%の症例が再発し、再発例には既知の予後不良因子(Philadelphia染色体)を持たない例が存在する。JAK2 遺伝子変異とCRLF2 の高発現を伴う再発細胞株2株を発見した。この2株は、抗がん剤と酸化ストレスに極めて強力な抵抗性を獲得していた。またCRLF2はIL-7レセプターα鎖とヘテロダイマーを形成してTSLP受容体として働き、JAK-STAT系を介してシグナル伝達すると考えられているが、変異型JAK2とTLSPレセプターが協調してCRLF2高発現株において、悪性化を促進していると示唆される。本研究では、JAK2変異-CRLF2高発現の標的分子と悪性化経路を特定することを目指している。
B-ALL小児患者から樹立したCRLF2高発現2株とそれ以外の株に対してトランスクリプトーム解析した。これらの解析より得られた結果から対象のRNAに対するsiRNAを作成してノックダウンを行っている。比較対象として既存経路のJAK2-STAT5系に対しては、JAK2選択的阻害剤および特異的siRNAによりノックダウンした。
候補のバリデーションを行い、変異型JAK2に対するsiRNAやJAK2に対する阻害剤を用いて機能解析をおこない、JAK2変異やPI3K-mTOR系が関与する細胞機能異常の解明を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

前年度のトランスクリプトーム解析より得られた結果から対象のRNAに対するsiRNAを作成した。樹立した細胞株にsiRNAトランスフェクションでノックダウンした。比較対象として既存経路のJAK2-STAT5系に対しては、JAK2選択的阻害剤（ルキソリチニブ）および特異的siRNAにより機能をノックダウンした。継時的に細胞を回収し、核酸抽出・タンパク抽出を行い以降の解析に供した。得られたRNAはリアルタイムPCR（Applied Biosystems 7500）を用いてバリデーションを行い、タンパク解析はウエスタンブロット法で解析した。ノックダウン前後で統計学的かつ機能的な意味づけをして候補となるシグナル経路や標的RNA・タンパク質を絞り込んでいる。

Strategy for Future Research Activity

新規の標的タンパク質を詳細に解析する。標的タンパク質はクロマチン免疫沈降 (ChIP)にて解析する。ChIPにて新たに候補となるRNAやタンパク質を見出した場合は、ノックダウン解析に戻り新たな解析を行う。
1)質量分析によるタンパク質解析（プロテオミクス解析）：ChIPで得られたタンパク質はトリプシン消化した後、そのペプチド溶液を2DICALによるタンパク質同時絶対定量法で解析する。得られたMS/MS データを用いて In-house にて Mascotで検索を行い、細胞株におけるタンパク質発現プロファイルを明らかにする。
2)ChIP-SeqによるDNA解析（次世代シーケンサー解析）：ChIPで得られたDNAは、ChIPと次世代シーケンサー（MiSeq）を組み合わせたChIP-Seqで、タンパク質、DNA、RNAの相互作用を精度良く調べ、転写因子やヒストン修飾の標的領域を網羅的に解析する。
3)化合物スクリーニング：細胞株に対して前年度に新しく見出した標的に対して化合物スクリーニングを行う。生細胞数をMTT assayにより、アポトーシスをcaspase-3/7活性を測定することにより評価する。JC-1で染色後、フローサイトメトリーでミトコンドリア膜電位を測定する。

Causes of Carryover

研究機関異動が予定されていたため執行を控えていた。
異動時期の遅延や研究費の移行に時間がかかり、年度内に執行できなたかった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に前年度執行予定のものを早急に行う予定である、