ナンセンス変異依存性mRNA分解制御による筋ジストロフィー分子治療効率化の検証

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19641
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 李 知子 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (10596042)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: Duchenne型筋ジストロフィー / リードスルー / ナンセンス変異 / ナンセンス変異依存性mRNA分解

Outline of Annual Research Achievements

Duchennne型筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy: DMD）に対する根治的治療の一つとしてmRNA上のナンセンス変異を読み飛ばし、ジストロフィンを産生させるナンセンスリードスルー誘導治療の開発が進んでいる。しかし、生体にはナンセンス変異依存性mRNA分解（nonsense-mediated mRNA decay: NMD）機構が備わっているため、ナンセンス変異を有するDMD患者ではmRNAが分解され、そのことが治療効果の妨げになっている。本研究の目的は、ナンセンス変異を有するDMD患者においてNMDを制御し得ることを明らかにすることである。DMD筋培養細胞において検討を進めるために、27年度はDMD症例におけるナンセンス変異の同定を行なった。ジストロフィン遺伝子MLPA法によって欠失・重複変異を認めないDMD症例の血液細胞より抽出したDNAを用いて、次世代シークエンサーあるいはサンガー法により塩基配列の解析を行ない、ナンセンス変異の同定を行なった。また、細胞培養系のセットアップを行なった。これらの症例の筋培養細胞により検討を進める予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本来であれば、ナンセンス変異を有する培養筋細胞を用いてジストロフィン遺伝子のmRNAの測定を行う予定であったが、現在は変異を同定し、細胞培養系のセットアップをおこなっている段階である。研究者の異動に伴って、遺伝子解析や細胞培養系の再確立に時間を要したために遅れている。

Strategy for Future Research Activity

1）ナンセンス変異を有するDMD患者由来培養筋細胞および対照培養筋細胞におけるジストロフィンmRNAをreal time PCR法により定量し、NMDの影響を明らかにする。
2）caffeine、wortmannin、Pateamine A あるいはUPF1に対するRNAiなどを用いてNMDを制御することによりmRNA量が増加することを検証する。
3）DMD患者由来培養筋細胞におけるアルベカシンによるナンセンス変異リードスルー誘導治療に、NMD制御を導入し、ジストロフィン蛋白発現が増加することを検証する。
4）ナンセンス変異を有するDMDモデルマウスであるmdxマウスにおいて、ナンセンス変異リードスルー治療にNMD制御を導入し、その有効性を検討する。

Causes of Carryover

試薬を予定よりも安価に購入できたため

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の試薬の購入などの研究費にあてる予定である