Genetic expression analysis of circulating tumor cells in patients with melanoma

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K19683
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 御子柴 育朋 信州大学, 医学部附属病院, 医員 (60747153)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: メラノーマ / 循環腫瘍細胞 / BRAF変異

Outline of Annual Research Achievements

【本年度の研究計画】　メラノーマ患者の循環腫瘍細胞（以下，CTC）を分離し，メラノーマに多くみられるBRAF遺伝子変異を解析する．治療の前後での変化を調べる．
【研究実施状況】
①CTCの分離：　間欠的露光部に発生した進行期メラノーマ患者１名から採取した血液をBDバキュテイナ採血管を用いて単核球を分離した．１回につき4mL，治療経過中の２回のタイムポイントについて解析した．メラノーマが発現するタンパク質に対する抗体で標識された細胞をCTCとして合計38個の細胞を単離した．
②CTCの遺伝子解析：　単離したCTCから個々にDNAを抽出した．DNAを用いて，BRAF V600領域を含むプライマーでサイクルシーケンスを施行した． 38個中 BRAF V600Kを２個検出した．内訳は，分子標的阻害薬治療前２個，治療後０個であった．
③CTCのmRNA解析：　10個の細胞から抽出したRNAはRT反応によりcDNAを合成して，mRNA発現に用いた．Digital droplet PCR法（以下，ddPCR）を用いて，mRNAの発現を調べた．10個のCTCのtotal RNAからcDNAを合成し，GAPDHとtyrosinaseのddPCRを行った．GAPDHは10個中２個のみがシグナルが得られたが，他の８個は検出感度以下であった．RNAの質的な問題やcDNA合成過程の問題と考えられた．よって，mRNAについては評価不能であった．
【達成できたことと今後の課題】　患者血液中に存在するCTCを単一細胞レベルで遺伝子解析することができた．本研究により，腫瘍循環細胞の単離と解析が，治療のモニタリングに役立つ可能性を示した．いっぽうRNA発現解析には，技術的な課題があることが分かった．CTC単離からRNA抽出までの過程で，迅速性が必要であることが示唆された．