2015 Fiscal Year Research-status Report
プロテアソーム機能不全単球からのIFN誘導ケモカインIP-10の産生機序の解明
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15K19700
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
稲葉 豊 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00647571)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 自己炎症疾患 / プロテアソ-ム / IP-10 / 中條ー西村症候群 / JAK/STAT |
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| Outline of Annual Research Achievements |
中條―西村症候群（NNS）患者と健常者の末梢血からCD14+単球を単離して検討する前に、まず、各人の末梢血にEBウイルスを感染させて作成した不死化B細胞を用いて各種条件設定を行うことを試みた。各人の同意を得て作成し凍結保存していた不死化B細胞を融解して培養し、10 IU/mlのリコンビナントヒトIFNγを添加して24時間後に細胞を回収し、パラホルムアルデヒドで固定後抗リン酸化STAT1-PE抗体で染色してFACSCaliburで解析したが、患者2名と健常者ともに同程度に軽度陽性に染まり、明らかな差は認めなかった。そこで、IFNγ添加0時間、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間後に細胞を回収し、M-Perにて溶解しSDS-PAGEに展開して抗リン酸化STAT1抗体を用いてウェスタンブロットを行ったところ、患者2名と健常者ともにIFNγ添加3 - 6時間後をピークに陽性バンドを検出し、バンドの濃さには明らかな差異を認めなかった。そこで、患者末梢血からpositive selectionでCD14+単球を単離して同様の実験を行うことを試みたが、得られる細胞数が少ないためか、IFNγ添加1時間、3時間、6時間後に明らかな陽性バンドを検出できなかった。そのため、まず健常者ボランティアの末梢血からpositive selectionとnegative selectionの両方の方法で十分な数のCD14+あるいは他細胞マーカー陰性の単球を得、IFNγ添加12時間後まで処理した細胞を回収して同様の実験を行い、陽性バンドを得ることを試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
交付申請時の、「NNS患者と健常者の末梢血からpositive selectionにてCD14+単球を単離し、24時間後に培養上清中にIP-10の産生が確認された10 IU/mlのIFNγを添加して、1時間から24時間後まで経時的に細胞を回収する。細胞膜、細胞質と核成分に分けて抽出し、可溶画分中の蛋白質が等量になるように分注して凍結保存し、適宜SDS-PAGEに流してメンブレンに転写し、冷蔵庫で保管する。これらのメンブレンを用いて、IFNGR1, IFNGR2, JAK1, JAK2, STAT1, SOCS-1とそのリン酸化物の抗体を用いてウェスタンブロットを行い、それらの発現量の変化を網羅的・定量的に検討する。患者単球と健常者単球の結果を比較することで、プロテアソームがIFNγ-JAK/STAT経路のどの部分に作用しているかを明らかにする」という研究計画に対して、キーとなるリン酸化STAT1の発現解析に手間取り、予定通り計画を遂行できなかった。類症であるCANDLE症候群にて、IFNγ刺激後の細胞内STAT1のリン酸化の亢進がFACSで認められると報告されていることから、細胞分画に分けて種々の抗体でウェスタンブロットを繰り返す前に、まずリン酸化STAT1について予想通りの結果を得ることが重要であるが、細胞の処理方法、生細胞数、IFNγ添加後の時間、分画の有無などの問題から、末梢血単球を用いたウェスタンブロットで有意なバンドが見られないものと考えられる。トラブルシューティングの方向は明確であり、早期にクリアして計画に追いつくことを目指している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度はまず、平成27年度に滞った「健常者末梢血から単離したCD14+単球にIFNγを添加して12時間後まで経時的に細胞を回収してM-Perにて溶解しSDS-PAGEに展開して抗リン酸化STAT1抗体を用いてウェスタンブロットを行い、陽性バンドを得る」ことから開始する。これで陽性所見が得られれば、NNS患者末梢血も同様に処理して健常者由来検体とともに多数のメンブレンを作成し、IFNGR1, IFNGR2, JAK1, JAK2, SOCS-1とそのリン酸化物の抗体を用いてウェスタンブロットを行い、抗体のチェックとともに細胞蛋白質全体での差異を検討する。同時に、健常者検体を細胞膜、細胞質と核成分に分けて抽出し、可溶画分中の蛋白質量が細胞全蛋白質の時と同じになるようにSDS-PAGEに流してメンブレンに転写し、これらのメンブレンを用いて、IFNGR1, IFNGR2, JAK1, JAK2, STAT1, SOCS-1とそのリン酸化物の抗体を用いてウェスタンブロットを行い、各分子の細胞画分間の動きも検討する。
以上の研究により、NNSにおけるIFNγ-JAK/STAT経路の異常が明らかとなれば、回復法の検討も試みる。具体的には、患者末梢血から単離したCD14+単球に、市販の20S/26Sプロテアソーム蛋白質を添加、あるいはNucleofactorシステムを用いて正常PSMB8遺伝子を導入、また逆に変異PSMB8遺伝子の発現を抑えるsiRNAまたはshRNAを導入、また既存のJAK/STATシグナル阻害剤をさまざまな濃度で添加し、IFNγ-JAK/STAT経路の異常についてウェスタンブロットで、培養上清のIP-10濃度をELISAで測定し、異常が消失しないか検討する。
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| Causes of Carryover |
進捗状況と今後の推進方針に記載したように、交付申請時の「NNS患者と健常者の末梢血から単離した単球にIFNγを添加して経時的に回収し、細胞膜、細胞質と核成分に分けて抽出し、IFNGR1, IFNGR2, JAK1, JAK2, STAT1, SOCS-1とそのリン酸化物の抗体を用いてウェスタンブロットを行い、それらの発現量の変化を網羅的・定量的に検討して患者と健常者の結果を比較することで、プロテアソームがIFNγ-JAK/STAT経路のどの部分に作用しているかを明らかにする」という研究計画に対して、キーとなるリン酸化STAT1の発現解析に手間取り、予定通り計画を遂行できなかったために、平成27年度に予定していた実験の多くを28年度に繰り越すこととなった。支出も計画通りとせず実験の遂行に合わせて行ったため、消耗品費の多くを28年度に繰り越すこととなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越額はすべて消耗品費に追加し、抗体や各種試薬、器具の購入に充てる。
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