2015 Fiscal Year Research-status Report
リアルタイムイメージング法を用いた放射線抵抗性浸潤細胞の解析
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15K19833
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| Research Institution | National Institute of Radiological Sciences |
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Principal Investigator |
藤田 真由美 国立研究開発法人放射線医学総合研究所, 重粒子医科学センター, 研究員 (80580331)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 放射線抵抗浸潤細胞 / 炭素線照射 / リアルタイム観察 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
重粒子線治療（炭素線照射による治療）は、これまでの臨床研究で高い抗腫瘍効果が示されているが、治療後の生存率をさらに上昇させるためには、再発及び浸潤、転移をいかに抑制できるかが重要である。課題代表者らは、これまでに31種のヒト癌由来細胞株を用いた検討により、炭素線照射はX線照射に比べ、大多数の癌細胞株の浸潤抑制に効果的であるが、ある特定の細胞株においては浸潤能が誘導されることを見いだした。では、なぜ特定の細胞株では炭素線照射後に浸潤能が上昇するのか。照射によるストレスに打ち勝ち、生き残り、さらに高い浸潤能を示す放射線抵抗性浸潤細胞の特徴を明らかにするため、本課題では照射後に生き残った細胞の挙動をリアルタイムに可視化する系を立ち上げた。細胞内小器官を蛍光ラベルし、照射後のストレス応答と細胞運動能の変化をリアルタイムに観察することで、全体の中で特に生き残り、かつ運動能が亢進する細胞群（放射線抵抗高運動細胞）がどのような細胞で、また、どのような過程を経て生じたのか明らかにすることを目的とし実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度（H27年度）はまず、細胞のミトコンドリアを蛍光染色し、照射後の挙動をリアルタイムに観察する系を立ち上げた。同時に、細胞の運動能を評価するため、96 well plateを用いた スクラッチアッセイ（創傷治癒アッセイ）をリアルタイムで観察する系を立ち上げた。その結果、照射後に生き残り高い運動能を示す細胞群では、ミトコンドリアの強固な染色像が確認されることが明らかとなった。また興味深いことに、細胞の移動方向にミトコンドリアが集積することを見いだした。これまでの研究にて、課題代表者らは、放射線照射後に高い浸潤能を示す細胞群は、一酸化窒素(NO)を産生する細胞群であり、NO-PI3K-AKT-GIRDINパスウェイを介して運動能が上昇していることを報告してきた(Fujita et al., FEBS Lett., 2014;588:3240)。NOは細胞内のミトコンドリア数を増加させ、細胞のATP産生を上昇させることが知られている(Tengan et al., Int J Mol Sci., 2012;13, 17160)。細胞が高い運動能を維持するためには、エネルギー源としてATPが必要であることから、NO産生細胞群が、高い運動能を示す理由の１つに、NOを介したミトコンドリア数の増加やATP産生の亢進が関与する可能性が考えられた。
初年度は、照射後の細胞を用いて細胞内小器官を蛍光染色し、照射を受けた細胞の挙動をリアルタイムで観察し、特に照射後に生き残り運動能が上昇する細胞群の特徴を捉えることを目的としたが、実際に、ミトコンドリアの染色像と細胞運動能を同時にリアルタイムで観察し、それら細胞群の特徴を見出すことができた。よって、「研究は概ね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞のストレスに対する応答として、小胞体から細胞質やミトコンドリアへ放出されるカルシウムのシグナルが重要であることが知られている。またこの過程では、小胞体とミトコンドリアの結合という物理的なコンタクトも必須となる。小胞体からミトコンドリアヘのカルシウムシグナルは、ミトコンドリアのエネルギー産生効率を変化させることも知られており、その後の細胞運動能に深く関わっていると予想される。本課題では、ミトコンドリアの他に、小胞体もER-Trackerを用いて蛍光ラベルし、カルシウムの流れとともに細胞内小器官の挙動や細胞の運動能をリアルタイムに観察することを試みた。しかし、小胞体の染色では、蛍光の退色が早く、試薬の細胞毒性が強かったため、ミトコンドリアのように安定した染色像を得ることができなかった。今後、さらに複数の試薬を用いて試行錯誤し、小胞体も合わせてイメージングすることで、放射線抵抗高運動細胞群がどのような細胞なのか、照射後のストレス応答過程で、それら細胞群では、例えば小胞体とミトコンドリアが結合するような像が得られるのか等、さらに検証する予定である。また、放射線抵抗高運動細胞では強固なミトコンドリアの染色像が確認されたが、実際にミトコンドリア数の増加やATP産生の亢進が見られるか、NOとの関連を考えながらさらに検証する予定である。
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| Causes of Carryover |
平成27年3月初旬に納品する予定で、免疫染色用の抗体を発注していたが、メーカーの都合で生産が間に合わなくなり、平成27年度内の納品ができなくなった。そのため、次年度に改めて発注することとし、その分の消耗品費を次年度に繰り越した。
繰り越した額：53507円
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度に購入する予定だった抗体を、繰り越し金で購入する予定である。
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