2015 Fiscal Year Research-status Report
創薬研究基盤の確立を目指した新規立体培養法によるiPS細胞由来肝組織の創出
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15K19863
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Research Institution | Keio University |
Principal Investigator |
高木 知聡 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (10626708)
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Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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Keywords | iPS由来肝細胞 / 間葉系幹細胞 |
Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度はヒト間葉系幹細胞を用いた機能的肝細胞の分化誘導法の確立について研究を進めた。具体的には、①iPS由来肝細胞の分化誘導と②iPS細胞からiPS由来肝細胞の分化誘導過程における間葉系幹細胞の導入を行なった。 ①iPS由来肝細胞の分化誘導に関しては、肝分化誘導を行った際に最もアルブミン産生能が高いとされる株の一つとして示されている201B6を用いることとした。分化誘導プロトコールは既存の報告に準じて行なった。分化誘導はいくつかの段階を踏むが、経時的な形態的評価に加え各段階に特異的な分化マーカーを用いた免疫染色を行い分化の程度を確認していった。結果、iPS細胞由来の肝細胞の作成をおこなうことができた。ただし、より安定した分化効率を求めてさらなる改良を進めている。 ②iPS細胞からiPS由来肝細胞の分化誘導過程における間葉系幹細胞の導入に関してはiPS由来肝細胞の安定した分化誘導ができるまで、既存の細胞としてiPS由来肝前駆細胞であるReproHepato™を使用した。これにより、細胞の質の均一化を図ることができた。また、間葉系幹細胞を導入する方法について、当初はTranswellを用いた間接共培養実験ではなく、MSCが分泌したタンパクを含有する培地(調整培地)を使用することとした。iPS由来肝前駆細胞からiPS由来肝細胞への成熟化の過程において、MSC調整培地を用いて成熟化したiPS由来肝細胞を、通常の方法にて成熟化したiPS由来肝細胞の機能を比較した。結果、MSC調整培地を用いて成熟化した細胞は通常の方法と比較して、形態的な変化はなかったものの、高いアルブミン産生、尿素産生、CYP3A4活性を示した。一部の機能的評価に留まるものの、MSCが分泌するタンパクが肝機能の向上に寄与した可能性が示唆された。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず、安定したiPS由来肝細胞の分化誘導については、現段階では比較実験に用いる程安定した分化誘導をするに至っておらず、現在も進行中である。本研究の全体の進行も勘案し、既存の細胞としてiPS由来肝前駆細胞を使用した。間葉系幹細胞との共培養についても、半透膜のinsertwellを使用した間接共培養では、十分な細胞数MSCを培養することができないことから、より適切実験内容を模索した。最終的には、研究実績の概要で述べた調整培地を使用することで安定した実験を行なうことができた。
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Strategy for Future Research Activity |
予定通り平成28年度は脱細胞化肝を用いた3次元培養下での機能的肝細胞の分化誘導法の確立を試みる。 ③生体由来細胞外マトリックス骨格の作成 分化誘導の全工程、もしくは一部を脱細胞化骨格内で行ない、生体由来細胞外マトリックスが成熟肝細胞への分化誘導にどのように寄与するか評価する。脱細胞化肝臓は以下のごとく定型化した工程で作成する。ラットより摘出した肝臓にトリプシンを還流させ細胞融解を起こし、さらに界面活性剤を還流させることで細胞を洗い流し脱細胞化を完了させる。 ④均一な質を持った再細胞化肝組織様構造の作製 脱細胞化骨格内に、iPS由来肝細胞様細胞を経門脈的に充填した後、培養液を門脈経由で持続的に還流することで循環培養を行なう。脱細胞化臓器骨格によって生体近似環境下での3次元培養を可能にすると考える。正常肝組織と比較して種々の代謝酵素発現・肝細胞機能解析を行い、肝組織としての成熟度を評価する。
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Research Products
(3 results)