2015 Fiscal Year Research-status Report
ストレス受容性を制御するmicroRNAは脳腫瘍の治療感受性を向上させられるか？
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15K19973
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
小川 大輔 香川大学, 医学部附属病院, 病院助教 (70524057)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | microRNA / グリオーマ / 薬剤感受性 / AMPK |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画ではmicroRNA-451（miR-451）がAMPKを抑制することで、脳腫瘍のストレス環境への適応性を阻害し、より多くの細胞をアポトーシスに導くことにより、テモゾロマイド療法（TMZ）や放射線療法（以下、併せて”治療”）に対する感受性を向上させることを目的としている。低グルコース等の代謝性ストレス環境下においてAMPKが活性化することは、細胞を生存させる上で必須であるが、最近、治療によっても腫瘍細胞のAMPK上昇が示され、治療に対する生存にも関与していると着想した。このことから、miR-451が治療後のAMPK活性化を抑制し、脳腫瘍の治療感受性を向上させることで、神経膠芽腫患者の生命予後を改善することを目指す。
本研究計画では、miR-451が治療感受性を向上させるか検討し、その発現を制御する転写因子を同定したのち、in vivoにおいても同様の結果が得られるか調べる。進め方としては、以下とする。
1.MiR-451、AMPKの発現・抑制系を用いて、治療感受性を調べる。2.発現制御因子のPPARγやOct1がプロモーターとして働いているか発現・抑制系を用いて確認する。3.ChIP assayを用いて、発現制御因子がmiR-451の遺伝子上流に結合しているか確認する。4.高血糖あるいは低血糖マウスを作成し、miR-451の脳における発現量を比較する。5.MiR-451安定発現細胞株を樹立する
6.安定発現細胞株を脳内に移植し、in vivoにおけるmiR-451の作用を調べる。7.安定発現細胞株を脳内に移植し、TMZをマウスに投与し、治療感受性が向上しているか確認する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MiR-451の脳腫瘍の化学療法・放射線療法感受性向上効果の検討として、治療ストレス（TMZ；0-1000uM、放射線；0-8Gy）に応じてAMPKが活性化していることをWestern blot法にて再確認した。TMZにおいては、薬剤濃度に応じてAMPKが活性化され、放射線では照射量に応じて活性化される傾向があった。MiR-451と、化学療法と放射線療法の各組み合わせで治療ストレスをかけ、細胞の生存率を比較し、治療感受性が向上していることを確認した。AMPK阻害剤（CompoundCなど）でも同様に放射線によるストレスをかけると細胞死が増加していることがわかった。MiR-451を発現制御する転写因子の解明として、PPARg、OCT1に関して、
それぞれの発現ベクターやsiRNAを用いてmiR-451がどのように動くか観察したところ、siOct1でmiR-451は発現減少し、siPPARgでmiR-451は発現上昇していることがわかった。またOct1KO細胞ではmiR-451は発現減少しており、Oct1はmir-451のプロモーターとして、PPARgはmir-451のサプレッサーとして、働いていることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
MiR-451に拮抗するanti-miRやAMPK活性剤のメトホルミンを投与し、レスキュー実験も行う。CompoundCがmir-451の発現に与える影響を調べる。Oct1とPPARg、それぞれのリガンドやノックアウト細胞で、miR-451の発現レベルを多角的に検討する。Oct1とPPARgの直接結合を示すために、ChIP assayを行う。逆に低糖状態やmiR-451過剰発現状態で、PPARγとOct1の発現がどのように変化するか調べ、ネガティブフィードバックの存在も観察する。Oct1ノックアウトマウスを用いてmiR-451の発現抑制が見られるか確認をおこなう。この2つの転写因子の他に、AMPKをノックダウンした細胞や、AMPK阻害剤（Compound Cなど）を投与した細胞についても同様の結果が得られるか確認する。
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