2015 Fiscal Year Research-status Report
悪性末梢神経鞘腫瘍の新規予後予測因子および治療法の開発：ヒアルロン酸を標的として
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15K19992
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
生田 国大 名古屋大学, 医学部附属病院, 医員 (40732657)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 癌 / 細胞・組織 / 肉腫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNST）におけるヒアルロン酸の役割を調査し，ヒアルロン酸合成阻害薬である4-Methylumberiferone（4-MU）を用いたヒアルロン酸制御がMPNSTにおける腫瘍原性に及ぼす効果を評価することで、従来の治療法とは異なるヒアルロン酸をターゲットとした新規治療法を開発することである。平成27年度の研究実績としては、ヒトMPNST細胞株（sNF96.2、sNF02.2）を用いたin vitro実験において、ヒアルロン酸量の評価について，ビオチン化ヒアルロン酸結合タンパク染色によりヒアルロン酸を可視化し、ヒアルロン酸濃度をELISA法，ヒアルロン酸が重要な役割を果たす細胞周囲マトリックス形成をParticle exclusion assay で定量した．また、増殖能、移動能、浸潤能をproliferation assay 、motility assay、invasion assayにて、アポトーシス活性をAnnexinVによるフローサイトメトリーで評価した。 ヒアルロン酸合成酵素3種のmRNA発現の評価のため定量的PCR法を行った。ヒトMPNST細胞株による皮下移植マウスモデルの作製については、諸家らの論文に記載された細胞数で手技を参照して実際に行っているが、腫瘍細胞は生着せず、モデル作製に時間と労力を要している。
MPNSTの半数は神経線維腫症1型患者から発生するとされている。当院では3年前から神経線維腫症1型患者の診療ネットワークが運用されており、他院から神経線維腫症を基盤としたMPNST患者の紹介症例が増えている。現在、手術により採取された免疫組織染色を行う臨床検体は40例程である。昨年度はパラフィン包埋したプレパラートを用いて、ヒアルロン酸結合タンパク染色、ヒアルロン酸合成酵素による組織染色を順次実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MUの抗腫瘍効果について、生体モデルを用いた実証が必要であるが、両MPNST細胞株による皮下移植マウスモデル作製が困難である。腫瘍細胞数を増やし、マトリゲルなどのマトリックス類似製剤やゲルを基材として培養、皮下移植を行ったが腫瘍細胞の生着がなかなか得られず、生着してもin vitro実験で見られたaggressiveな増殖を示さずサイズ増大も乏しい。宿主としてBALB/c nu/nuマウスを使用していたが、宿主側の免疫系の問題を考慮して、重症糖尿病免疫不全マウスに対しても同様の投与、移植を行ったが腫瘍細胞の生着は得られなかった。このため、当初計画していたin vivo実験を進めることができていない。今後の方針としては、一旦生着した腫瘍細胞をin vivoで継代することで、MPNST皮下移植マウスモデルを作製することを目指す。当初は、sNF96.2およびsNF02.2両方のin vivoモデルを計画していたが、モデルが確立できたMPNST細胞株1種のみでの評価となりうる可能性も考慮される。
in vitro実験についてはウエスタンブロットが未評価である。ex vivo実験では、臨床検体の収集は順調であるが、免疫染色が全例に対しては実施されていない状況である。全体として判断すると、実験計画自体はやや遅れていると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
当教室にて保存している神経線維腫症1型とMPNST患者血清を使用し、外部委託によりヒアルロン酸濃度を測定する。得られたデータを健常成人における血清ヒアルロン酸濃度と比較し評価する。また、ヒアルロン酸，ヒアルロン酸合成酵素，ヒアルロン酸分解酵素の発現結果と各症例の臨床データ（年齢，性別，腫瘍サイズ，発生部位，発生深度，組織学的悪性度など）間の統計解析を行う。また生命予後、局所再発、遠隔転移についてKaplan-Meier法を用いて検討し、それぞれの発現の関連性についてLog-rank法にて統計学的解析を行う。実際に4-MUを臨床応用する場合，抗癌剤との併用療法となる可能性を念頭に置き、MPNST細胞株における4-MUとドキソルビシンの併用効果の確認をin vitro実験において実施する。MPNST異種移植モデルの確立後に、4-MU投与群、コントロール群における移植腫瘍のサイズ計測および解析、組織染色によるヒアルロン酸発現，免疫組織化学染色によるヒアルロン酸合成酵素およびヒアルロン酸分解酵素の発現の解析を行う。
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| Causes of Carryover |
１．実験計画では3種類のMPNST細胞株での実験を計画していたが、本年度は2種類の細胞株でin vitro実験を行ったため。
２．MPNST皮下移植モデルが確立できず、時間を要した。そのため臨床検体を用いた免疫組織染色の進捗に遅れをきたしたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
皮下腫瘍マウスモデル作製のためのマウス購入費、飼育費および組織染色に必要な各種抗体の購入のために研究費を使用する。
今後、研究結果の発表に関連する学会および論文校正費用、また研究に関連する書籍の購入費用に研究費を使用する。
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