炎症性サイトカインによる筋萎縮に対しα７アセチルコリン受容体刺激が与える影響

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K20027
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 笹川 智貴 旭川医科大学, 医学部, 講師 (30400112)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: アセチルコリン受容体 / 筋肥大 / ミトコンドリアバイオエナジェスティクス

Outline of Annual Research Achievements

昨年度はC2C12細胞の培養系を確立し、その後低栄養培地のウマ血清を用いて安定した筋管形成を得ることができた。この筋管径の測定とウエスタンブロッティング法によるミオシン重鎖の測定系を確立することができた。GTS21によって筋管径は増大し、ミオシン重鎖の有意な増加を認めた。また、ギムザ染色を行い筋管画像の染色を行ってヒストグラム解析による定量を行うことができた。筋芽細胞は筋管形成に進むにつれて染色の濃度が増加し、画像の濃淡を数値化することで分化の度合いを定量化することができた。この実験系を基礎として、初年度よりミトコンドリアバイオエナジェスティクス変化の実験系の立ち上げを行ってきたが、昨年度、良好に酸素消費量を検出できる細胞数や薬物濃度を確定することができた。特に薬剤の作用部位を決定するための基礎酸素消費量やATP産生関連酸素消費量、アンカップリング関連酸素消費量、ミトコンドリア最大酸素消費量のコントロールを得ることができている。しかし、その後に行う予定であったGTS21の反応性についての検討にいたってはまだ実験途中の段階である。また、炎症性サイトカインミックスによる筋管萎縮モデルの確立には難渋しており、過去に報告された濃度での生育が難しく今後それぞれのサイトカインの濃度をより細かく設定し直すか、新しいロットを模索して再度研究を行う、もしくは表現形には現れにくい萎縮と判断し、RNAレベルや蛋白レベルでの検討を続けるか検討課題である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

C2C12細胞に対するGTS21の反応性についての検討にいたっては実験条件の決定まで時間を要したため、今年度GTS21の反応性について検討できる予定でありまだ実験途中である。また、炎症性サイトカインミックスによる筋管萎縮モデルの確立には難渋しており、過去に報告された濃度での生育が難しく、さらに濃度条件を設定して筋管径の測定を行う段階である。

Strategy for Future Research Activity

ミトコンドリアバイオエナジェスティクス変化の実験系についてはGTS21の反応性を確認するのみとなっており、十分な実験結果が得られると考えられる。炎症性サイトカインミックスによる筋萎縮モデルの確立は、ロットの異なるサイトカインの購入や、筋管径に変化がみられない場合はミオシンなど蛋白発現レベルでの変化の有無がないかどうかウエスタンブロッティング法に進んで検討を行う必要もあると考えている。

Causes of Carryover

炎症性サイトカインミックスによるC2C12の筋萎縮が得られず、その後の萎縮筋に関連する実験系が進まなかったことが大きな要因と考えられる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

萎縮筋管が得られた後に行う予定であったウエスタンブロッティング法に使用する抗体やプライマー、筋管萎縮再作成に用いる炎症性サイトカインの再購入にあてる方針である。