2016 Fiscal Year Research-status Report

iPS細胞による癌幹細胞モデルを活用した全く新しいdecoy 療法開発の試み

Research Project

Project/Area Number	15K20135
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	多賀谷光山梨大学, 総合研究部, 助教 (50418711)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	癌幹細胞治療 / ヒトパピローマウイルス / ゲノム編集
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、癌幹細胞をターゲットとした新しい治療方法を見出すことを目的とし、開始当初は培養癌細胞及び臨床検体から分離培養した癌細胞を用いて癌幹細胞モデルを作成し、その特性解析を行いながら増殖能や浸潤能を調整したdecoy幹細胞を調製することを目指した。培養癌細胞については、遺伝子導入技術により幹細胞様細胞を得ることに成功し、オリジナルの癌細胞と比較して細胞形態や増殖能などの特性の変化が確認できた。前年度、正常体性幹細胞と癌幹細胞を区別して検証するために、子宮頸癌患者の末梢血中からヒトパピローマウイルス(HPV)遺伝子を保有し、かつ幹細胞様性質を有する細胞を回収し特性解析することを着想した。末梢血中にcell free DNAを証明することはできたが、細胞の検証については、その確立の低さから、網羅的な特性解析は難航し、研究の遂行は困難であると判断した。そこで、別の手法による癌幹細胞をターゲットとした治療法の可能性について検討した。子宮頸癌はHPVが子宮頸部上皮の中の、円柱上皮扁平上皮境界に存在する幹細胞様性質を有する予備細胞に感染することを契機として、持続感染を経て宿主ゲノムにウイルスゲノムの特定領域(E6およびE7領域)がインテグレーションすることで cervical interaepithelial neoplasia(CIN) という前癌状態を経て癌へと至る疾患である。E6あるいはE7領域を有する幹細胞は、他の正常体性幹細胞とは明確に区別することが可能であり、この特定領域に対してゲノム編集を施すことで腫瘍性性質の調製を図ることを着想し、検体とする癌細胞とゲノム編集技術の確立に向けた準備を開始した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 当初着想した癌幹細胞モデルを利用した治療法の開発については、特性解析の段階で問題が生じたため、新規治療法の立案が必要となった。近年急速に技術が向上しているゲノム編集は、ウイルス性発癌の領域でも大いに注目されており、子宮頸癌領域についての研究も幾つか報告されている。一方で、本邦では若年者の子宮頸癌及びその前癌状態の罹患率が上昇していることが問題となっているが、若年者の前癌病変では子宮頸部の部分切除という妊孕性にも影響を及ぼす治療が施されることもあり、少子化問題をさらに深刻なものとする可能性を秘めている。今回新たに着想した治療法は、前癌状態でE6およびE7領域のゲノムインテグレーションをきたしている幹細胞をも対象とすることが可能であり、外科的治療法しか存在しなかったCINの画期的な治療法の一つとなり得るものであり、確立へ向けて29年度以降多くの検証を続けていくことを予定している。
Strategy for Future Research Activity	HPV陽性子宮頸癌細胞株を用いたゲノム編集研究については報告されており、CRISPR/cas9システムを用いてHPV E6およびE7領域のゲノム編集によりがん抑制遺伝子を活性化し細胞増殖の抑制やアポトーシスの誘導を促進することが示唆されている(White etal. Discov Med. 2015)。一方で、HPV感染細胞のE6あるいはE7領域遺伝子のコピー数と病変の悪性度には相関があることも報告されている(Wang-Johanning et al. CANCER. 2002)。そこで、まずはCRISPR/cas9システムにより、HPV陽性子宮頸癌細胞株のE6あるいはE7領域ゲノムのコピー数の変化について検討することから開始する。次にコピー数の変化と腫瘍性細胞性質の変化の相関性について検証し、さらにはCIN～子宮頸癌臨床検体を用いて同様のゲノム編集とコピー数の変化の検討を、病変の悪性度毎に分けてまとめる。最終的には、生体での遺伝子導入の手法について、安全性を考慮したものを検討していく。
Causes of Carryover	末梢血中HPVゲノム陽性かつ幹細胞性質を有する細胞の分離と特性解析を行う予定であったが、確保できた細胞の数の少なさより、細胞の特性解析が限定的なものとなり、当該年度所要額の減少につながった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	癌幹細胞をターゲットとした新規治療法の確立に向けて、CRISPR/Cas9によるゲノム編集システムを整備する。HPV E6あるいはE7領域を対象としたガイドRNAの新規設計、対象細胞への導入試薬、遺伝子発現の変化を確認するためのPCRプライマーの新規設計などでの利用を想定している。