3次元口腔粘膜モデルを用いた分子・細胞レベルでの義歯床下骨吸収メカニズムの検証

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K20432
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 塩見 晶 新潟大学, 医歯(薬)学総合研究科, 特任助教 (80736653)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 口腔粘膜インビトロモデル / 義歯装着 / 顎骨吸収 / 口腔粘膜上皮細胞 / 口腔粘膜線維芽細胞 / 破骨細胞 / osteoprotegerin / RANKL

Outline of Annual Research Achievements

顎骨吸収は義歯の維持安定を困難にする一大要因であり、咀嚼が満足に行えないことは高齢者のQOL(Quality of Life)を著しく低下させる。
本研究では、義歯装着における顎骨吸収のメカニズムを解明することを最終目的として、ヒト口腔粘膜上皮細胞とヒト口腔粘膜線維芽細胞を共培養した3次元培養口腔粘膜モデル (three-dimensional oral mucosa model, 3DOMM)に反復加圧刺激を加えることで義歯装着による口腔粘膜への圧力刺激を培養環境下でシミュレートし、口腔粘膜組織が放出する液性因子の解析と、それによる骨芽細胞の細胞増殖能や骨基質分泌量、破骨前駆細胞の分化の割合への影響を明らかにすることを目的とした。
Osteoprotegerin (OPG)は破骨細胞分化誘導因子RANKLのデコイ（おとり）受容体であり、RANKLとその受容体であるRANKの結合を競争阻害し、破骨細胞の分化と骨吸収機能を阻害する。
培養圧縮装置を用いて3DOMMに反復加圧刺激を加えた後、回収した培地中に放出されたOPGの濃度をELISAにて定量し、3DOMMに発現したRANKLを免疫組織化学的に検索した。また、OPGに関しては単層培養した上皮細胞と線維芽細胞に対してもELISAにて定量解析を行った。3DOMMの結果から骨形成と骨吸収がともに亢進し高代謝回転型の骨吸収が惹起されることが予想され、単層培養の結果から培地による影響や上皮細胞と線維芽細胞のクロストークによる影響が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画では、平成27年度に(1)3次元培養粘膜モデル(3DOMM)の作成とサンプル回収・処理、(2)培養上清サンプルの解析、(3)3DOMMの組織学的・免疫組織化学的検討、平成28年度に(4)3DOMMが放出した液性因子がヒト骨芽細胞と破骨細胞に及ぼす影響の分析を行う予定であったが、今年度は(1)のサンプルの回収と(4)の破骨細胞の培養を開始するに留まり、(2)(3)の解析が遅れている。しかし、(2)に関しては今年度末に実験室にマルチプレックス解析装置が導入されたためサイトカインの網羅的解析が可能であり、平成28年度予定であった(4)の破骨細胞培養開始に成功しているため、計画通りに研究を遂行できる見込みである。

Strategy for Future Research Activity

当初培養上清サンプルの分析にはELISA法を用いる予定であったが、今年度導入されたマルチプレックス解析装置を用いることで複数のタンパクを同時に定量することができるようになったため、所要時間の短縮が期待できる。これにより、骨代謝に関係するサイトカインを定量解析する。
3次元培養粘膜モデル(3DOMM)が放出した液性因子が骨芽細胞と破骨細胞に及ぼす影響の分析においては、3DOMM培養上清添加による骨芽細胞の骨基質分泌量や破骨細胞の分化の割合の変化を解析する予定であるが、より生体に近い状態である3DOMMとの共培養や、より基礎的である単独培養での反復加圧刺激による変化についても検討していく。

Causes of Carryover

物品購入等の納品検収は平成27年度内に完了したが、支払いが4月となり次年度となったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成27年度内に執行済みであり、支払いは4月に完了している。