脱灰象牙質を用いた骨再生とその界面組織の3次元的微細構造解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K20497
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 田上 隆一郎 久留米大学, 医学部, 助教 (40597457)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 脱灰象牙質 / FIB/SEM / 骨再生

Outline of Annual Research Achievements

H27年度の第一研究目的は脱灰象牙質 (demineralized dentin matrix; DDM) をラット頭蓋骨欠損モデルに移植後, 骨新生の程度をμCTにて経時的に観察することであった. 過去の報告では部分脱灰したDDM顆粒の500～1000μ程度がより骨ができる条件とあったが, 次世代走査型顕微鏡 (Focused-ion beam;FIB/SEM) にて来年度以降試料を観察するにあたり500μ以下のDDMのほうが, 操作性がよかった. H28年度には同試料を用いて, 新生骨と象牙質の境界面をFIB/SEMトモグラフィー 法にて超微形態解剖学的なアプローチを行い, 骨形成に関与する細胞・組織間のネットワーク・組織構築およびその変化を検証するため, 本実験の移植片の条件は完全脱灰の180~500μ程度のサイズのDDMを使用した.
6週齢SDラットの頭蓋骨に対し, インプラント用トレフィンバーにて6mm大の欠損を作成した. DDM移植群とコントロール群として何も移植しない群を比較して, 0, 2, 4, 8, 12週目にそれぞれμCT撮影を行った. その結果肉眼的な新生骨量の差は４週目以降出現し, 12週目にして有意差を確認した. 現在電子顕微鏡用に超薄切片を作成後, 収束Gaイオンビームにより試料表面を連続的に切削し, 画像取得を繰り返すことで目的の界面空間を定量化している.

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は移植モデルの確立と移植後のμCT撮影を中心に研究を遂行した. 当初移植していたDDM顆粒サイズではうまく骨組織を形成しないこともあり, 参考にしている論文の著者の口演を拝聴するために学術集会に参加し, また直接研究室に行き, 移植法を見学させてもらうことで本研究のモデルを確立することができた. 脱灰条件についても研究協力者から助言を受け, 研究をすすめるにあたり, 大変参考になった. また欠損サイズも小さすぎると, 自然治癒することもあり, 6mmとするまでに試行錯誤した.
μCTの使用法については過去にも使用していたものであったため, スムーズに観察を行うことができた. 検証項目についても統計データを整理し, 有意差を確認できている.

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は電子顕微鏡試料から脱灰象牙質と形成骨表面の境界面に注目して3次元的解析を行い, 周囲の骨細胞ネットワークを含めた組織構築の関係性を明らかにする. 一塊としてラットから摘出した試料は, ハーフカルノフスキー液にて固定し, 樹脂包埋後, FIB/SEMによる目的領域の観察を行う. FIBによる試料表面の連続的切削とSEMによる画像の取得を繰り返すことで骨組織約80μm角の空間を3次元的な再構築を行う. 取得したデータは画像解析ソフトパソコン上でAvizo 8.1ソフトウェアを用いて3次元再構築を行う. ３次元再構築を行うことで象牙細管内と周囲骨細胞との関係を明らかにすることで今後の骨再生研究の一助になると考える.

Causes of Carryover

μCT撮影データの解析用統計ソフトを購入予定であったが, 本年度にバージョンアップされたソフトが発売されるとのことでH27年度末の購入を見送りにした結果, 残高が生じた.

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度は同ソフトに加え, 画像解析・計測ソフトの購入を予定している. 電子顕微鏡試料から得るデータにて, ３次元的解析を行い, 移植脱灰象牙質と新生骨組織との関係性を解明する.