2016 Fiscal Year Research-status Report
脂肪幹細胞（ASC）とFibrinを用いた骨芽細胞シートによる骨形成能の評価
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15K20527
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
松原 正和 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (50736551)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 骨再生 / 脂肪幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（研究目的）これまで骨再生分野において骨髄由来幹細胞が主流であったが、近年脂肪組織由来の間葉系幹細胞（Adipose mesenchymal stem cell：ASC）を用いた試みが注目されている。本研究ではASCを用いた再生療法を想定しIn Vitroでの細胞特性を調べ、さらにIn Vivoにおける移植実験までを一貫して行い、その有用性を検討する事を目的としている。そして動物への移植法には新たな試みとして同種生物血液より精製したフィブリンシートとASCの複合移植を行い、その有用性を多角的に検証する。本研究は完全自己由来の媒体を用いた移植法をモデルしたものであり、倫理的また安全性を重視する再生分野において新規性のある研究である。
（研究結果概要）本研究ではICR雌性マウスよりASC細胞株を樹立した。ASC細胞株は約40代にわたり長期培養が可能であり、骨髄幹細胞同様に骨・軟骨・脂肪への分化能を有する。骨髄由来幹細胞および骨芽細胞株であるMC-3T3との対比実験を行なった。In Vitroでの培養細胞から骨誘導後のOsteocalcin・Runx2、BMPー７の発現量を定量した結果、AScからの発現量は骨髄由来幹細胞と同程度であった。またH２８年度よりIn VivoでのASC移植受験を開始し、骨誘導後のASCがコラーゲン複合体との移植においてヌードマウス皮下での骨形成に成功した。移植実験ではGFP陽性マウスからのASC株を使用したが、移植後の新生骨組織にはGFP陽性細胞が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は概ね順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究推進対策として以下の手順にて推進する。
①フィブリンシートを基盤とした骨芽細胞シートの精製：ASC採取時に同一ドナーより採血した血液をRodellaらの報告にて開発された遠心分離システムMEDIFUGE○Rを使用しFibrinogenおよびThrombinを分画する。これらをシャーレ内で反応させ、成長因子を含んだFibrin重合体（フィブリンシート）を作成する。(Rodella LF,et al,Microsc Res T
②ヌードマウスを用いた骨芽細胞シート移植実験：移植動物としてヌードマウス（BALB/c,雌性，6週齢）を用いる。移植後2，4，6週群を設定し、期間終了後に移植片の摘出を行う。また移植部位における細胞の生存は470nmのGFP照射装置にて確認を行う。
③X線学的解析による形成骨の形態学的検討：摘出移植片は10％ホルマリン固定後動物用μCT撮影装置（R-mCT,Rigaku社製）を用い撮影を行う。撮影した画像は骨形態計測解析ソフトウェア（TRI/3D-BON,RATOK社製）にて3次元構築を行い骨形成パターンについて形態学的に検討する。
④形成骨の組織学的解析および各免疫組織学的検討：上記③終了後に摘出移植片はパラフィン切片を作成する。まずHE染色にて新生骨の程度を確認する。さらに抗Osteocalcin，抗Runx-2抗体の発現を免疫染色法にて検討を行い、Alkaline Phosphatase-TRAPの2重染色法にて局所における骨リモデリング様式についても検討する。また形成骨基質内の骨細胞が移植細胞由来かを抗GPF抗体を用いた免疫染色を行う。
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| Causes of Carryover |
H28年度は遺伝子解析を主体として計画していたが、H28年度計画分について一部前年度に先行して行なった。またH28年度計画していた細胞移植実験の一部をH29年度に延期し行う様に、研究計画を変更した。このように研究計画の変更により次年度使用顎に差が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H28年度計画分の移植実験については、移植を行う細胞株の樹立は成功しているため、計画の一部を次年度に延期し行う予定である。
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