舌筋由来幹細胞とbioactive scaffoldを用いた新規骨再生法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K20535
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 梅田 浩嗣 山口大学, 医学部附属病院, 診療助教 (90610618)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 舌筋由来幹細胞 / Nanog / 骨再生 / マウス舌筋

Outline of Annual Research Achievements

addgene社からマウスNanog遺伝子発現ベクター(pPyCAG-Nanog-IP)を購入し、トランスフォーメーションを行い、大量培養し精製後、このプラスミドベクターを、リポフェクタミンを用いて、舌筋由来Sca-1陽性細胞 (MTDSC)に遺伝子導入し、上記ベクターのSelection markerであるPuromycinを用いてstable cloneを作製した。このトランスフェクタント(MTDSC－Nanog)を親株であるMTDSCおよび空ベクターを導入したMTDSC－puroと細胞増殖能および骨分化能に関して比較検討した。その結果、親株MTDSC、空ベクターを導入したMTDSC－puro、MTDSC－Nanogは増殖能に関しては有意差を認めなかった。しかしながら、MTDSCにおいてはAlizarin red染色およびVon Kossa染色にて観察される石灰化細胞外基質の形成が14日目以降に確認され、空ベクターを導入したMTDSC－puroにおいても同様に14日目以降に確認できたが、MTDSC－Nanogでは10日目以降に石灰化細胞外基質の形成が認められた。なお気孔性炭酸アパタイトフォームの試作品も作製できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Nanog遺伝子発現ベクター(pPyCAG-Nanog-IP)を用いて、舌筋由来Sca-1陽性細胞(MTDSC)に遺伝子導入し、stable cloneを作製できており、親株や空ベクター導入株と細胞増殖能および骨分化能が比較検討できており、炭酸アパタイトフォームの作製も進み、in vivo実験の準備が進められていることから、ほぼ順調に実験計画が進んでいると考えている。

Strategy for Future Research Activity

気孔性炭酸アパタイトフォームの試作品を用いて、ゼラチンハイドロゲル膜の２層構造(外側は３ヶ月程度の分解性と強度を有し, 内側は２週間程度の薬剤の徐放性を有する)で覆った３次元構造を有するbioactive scaffold（ゼラチン炭酸アパタイトフォーム）の作製を進める予定である。この進行状況にもよるが、次にゼラチンハイドロゲル膜の内層からbFGFの徐放が可能な３次元構造を有するbioactive scaffold（bFGF炭酸アパタイトフォーム)の作製を進める予定である。

Causes of Carryover

Nonogを発現するStable cloneを得るために時間がかかったために、Stable cloneと空ベクター導入株ならびに親株における骨分化マーカーの発現の検索が残ったために、物品費の使用の一部を次年度に回し、Western blot.に必要なゲルや試薬の購入に当てる考えである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

親株、空ベクター導入株、Stable cloneにおける骨分化マーカーの発現の検索を行うために、Western blot.に必要なゲルや試薬の購入に使用する予定である。