DSCAMおよびnetrin-1の骨代謝における機能の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K20556
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 榎木 祐一郎 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (30734199)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: DSCAM / netrin1

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度の実験計画として，netrin1の骨関連細胞への作用の解析およびDSCAMノックアウトマウスを作製することを予定としていた．mixed background DSCAMノックアウトマウスを作製するにあたり，理化学研究所バイオリソースセンターよりC57BL/6マウスを背景としたDSCAM+/-マウスを入手した．このオスマウスとメスのBALB/c背景の野生型マウスと交配させヘテロ接合体DSCAM+/-mixマウスを作製した．このヘテロ接合体マウス同士を交配させ，ホモ接合体DSCAM-/-mixマウスを作製し，genotypingでDSCAMノックアウトマウスであることを確認した．また，マウス作出の間にnetrin1の骨芽細胞および破骨細胞に対する作用の解析をおこなった．骨芽細胞に関しては，骨芽細胞様細胞株のMC3T3-E1とprimary cellとして胎児マウス頭蓋骨より採取し，単離した細胞を使用した．それぞれの細胞を培養し，recombinant netrin1のを作用させ，アルカリ性ホスファターゼ(ALP)の活性を確認し，細胞遊走能試験および細胞増殖能試験を行った．破骨細胞に関しては，BALB/cマウスの骨髄より骨髄細胞を採取して，M-CSFで処理して骨髄マクロファージを作製し，RANKLを作用させ破骨細胞を形成するとともにrecombinant netrin1のを作用させた．netrin1の添加による破骨細胞数を再確認した．また，骨髄由来の破骨細胞や頭蓋骨由来の骨芽細胞や骨芽細胞細胞様株のnetrin1およびDSCAMの発現を再確認した．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ｍixed background DSCAMノックアウトマウスを作製するにあたり，理化学研究所バイオリソースセンターより入手したC57BL/6マウスを背景としたDSCAM+/-マウスとBALB/c背景の野生型マウスと交配させ，作出したヘテロ接合体DSCAM+/-mixマウス同士を交配させるため，時間を要している．また作出した25％がヘテロ接合体DSCAM+/-mixマウスであったが，それらを交配させ300匹のマウスを作出したが，300匹のうちホモ接合体DSCAM-/-mixマウスは6匹であった．序盤にDSCAMノックアウトマウスが作出できず，プロトコールの見直しなどで時間を要した．

Strategy for Future Research Activity

ｍixed background DSCAMノックアウトマウスの作出の手順を確立できたため，実験に必要なサンプル数を考慮しながら交配を行い，作出していく予定である．また，骨芽細胞に関して，netrin1を作用させ，ALP, collagen-1, osteocalcinなどの骨芽細胞分化マーカーについての遺伝子やタンパク質に対して経時的な発現を確認する．また破骨細胞に関して，netrin1を作用させ，NFATc1, cathepsin K, calcitonin receptorなどの破骨細胞分化マーカーについての遺伝子やタンパク質に対して経時的な発現を確認する．

Causes of Carryover

実験計画よりやや遅れ気味で，細胞培養実験の期間が短かったため

Expenditure Plan for Carryover Budget

物品費として消耗品の購入に使用する予定です．