2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K20564
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
横山 愛 日本大学, 松戸歯学部, 助教 (70610252)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 唾液腺傷害 / 細胞間コミュニケーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大唾液腺は左右対称に1対ずつ存在し、一方の唾液腺が頭頚部癌の治療のための放射線照射などの傷害を受けると放射線照射された唾液腺の唾液分泌機能は低下するが、非傷害側の唾液腺が傷害側の唾液腺機能を代償するという報告がある。本研究では、左右の大唾液腺間における唾液腺分泌機能亢進メカニズムを解明することが目的である。
本年度は、平成27年度の研究実績で報告した片側耳下腺排泄導管の結紮時における傷害側と非傷害側の耳下腺、偽手術の非傷害側（コントロール）の耳下腺における重量変化の結果とHE染色による形態学的変化、Ki67抗体を用いた免疫組織化学染色による陽性細胞染色態度の違いについて、第58回歯科基礎医学学術大会で発表を行った。また、結紮4日目と7日目の各耳下腺の体重当たりの重量を求め統計分析を行った結果、結紮4日目では傷害側と非傷害側、傷害側とコントロール、非傷害側とコントロール間において差があることがわかった。結紮7日目では傷害側とコントロール間のみに差があることがわかった。各耳下腺細胞の増殖能観察するためにKi67染色を施した各スライドについて、陽性細胞と陰性細胞の数を数え陽性細胞率で評価した。陽性細胞率は結紮4日目では傷害側で最も高く、非傷害側、コントロールの順であったが、非傷害側とコントロールでは陽性細胞率にほとんど差はなかった。一方で結紮7日目では、4日目と同様に傷害側で最も高値を示し、非傷害側、コントロールの順であった。しかし、非傷害側はコントロールと比較して有意に高値を示した。以上のことから、非傷害側の唾液腺が傷害によりなんらかの影響を受けていることは明らかであり、マイクロアレイ解析を行うサンプルとしては結紮７日目のサンプルが妥当ではないかという結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度では、すでにマイクロアレイ解析が終了し、シグナルの同定が行われている計画であった。しかし、マイクロアレイ解析のためにマウスから耳下腺を摘出しRNAの抽出を行ったところ、傷害側唾液腺は萎縮しているため通常の唾液腺より小さく、サンプルのRNA純度（A260/A280）の値が低値であった。そのため、高い純度のRNAを得るために条件を再検討するのに時間がかかってしまった。最終的には傷害側の唾液腺の個数を増やすことで良好なRNAの純度を得ることができた。続いて、マイクロアレイ解析のために各サンプルのRNA Integrity Number (RIN 値)を測定したところ、サンプルにRIN値が合格基準である7以上を満たさないサンプルがあり、RNA抽出の条件を再検討し再度サンプルを用意する必要があるため、ややおくれていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、研究計画調書に沿って研究を続ける。
まず、マイクロアレイ解析を行う。得られたデータ解析からコントロールと比較して非傷害側で遺伝子発現が2倍以上ある遺伝子に着目しGene Ontology解析、Pathway解析を行う。目的遺伝子の候補の決定については、傷害側と非傷害側でリガンド対レセプターの関係が予測されるものを候補とする。次に、傷害側で目的遺伝子を非傷害側で目的遺伝子に対するレセプターの遺伝子発現をリアルタイムPCRで確認し、タンパク質発現をイムノブロット解析で観察する。最後に、マウス耳下腺を摘出し細胞単離処理を行い腺房細胞の培養を行う。培養腺房細胞に候補に挙がったタンパク質を作用させ、タンパク質による耳下腺への影響を観察し唾液腺分泌がどのように亢進するのかを検討する。
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| Causes of Carryover |
現在までの進捗状況にも述べた通り、RNAの純度を高くする条件を検討するのに時間を要した。純度の高いRNAが精製できた後も、RNAの分解経過を評価したRIN値がマイクロアレイ解析を行うための合格基準値に達していないことが判明し、もう1度サンプルを取り直さなければならない状況になったため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は、マイクロアレイ解析を行うために使用する。その内訳としては、実験動物、マイクロアレイスライド、消耗品である。
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