2015 Fiscal Year Research-status Report
メカニカルストレス刺激時の骨芽細胞におけるエピジェネティックな骨形成機構の解明
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15K20576
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
解良 洋平 東北大学, 大学病院, 助教 (90647950)
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2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エピジェネティック |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨芽細胞におけるエピジェネティックな遺伝子発現制御を明らかにするために、マウス骨芽細胞様細胞株（MC3T3-E1）を用いて以下の実験を行った。
1.MATIIがOsterix遺伝子の発現を抑制しているか検証：不死化したマウス胎児線維芽細胞においてメチオニンアデノシル転移酵素（MATII）がCOX2遺伝子発現を抑制している報告がある（KeraY et al.JBC.2013）。MATII阻害薬ｼｸﾛﾛｲｼﾝを用いてMATIIの機能を低下させた骨芽細胞およびコントロールの骨芽細胞からmRNAを抽出し、定量PCRを用いてOsterix遺伝子の発現量を解析したところ、Osterix遺伝子発現を抑制していることが示唆された。
2.Smad3がOsterix遺伝子の発現を抑制しているか検証：Osterix遺伝子プロモーター領域上に転写因子Smad3の結合しうる領域が存在し（Nishio.Y et al.Gene,2006）、これらは抑制性ヒストンメチル基転移酵素Setdb1（Pei et al.Cancer Res,2014）,Suv39h1(Yu et al.JBC,2011)と相互作用を持ち標的遺伝子の発現を抑制している報告がある。MC3T3-E１細胞において、Smad3はOsterix遺伝子発現を抑制しているか検証した。Smad3ノックダウンおよびコントロールの骨芽細胞からmRNAを抽出し、定量PCRを用いてOsterix遺伝子の発現量を解析したところ、Smad3はOsterix遺伝子の発現を抑制していることが示唆された。
3.MATIIとSmad3が相互作用しているか検証：MATIIとSmad3はOsterix遺伝子を抑制していることが示唆され、これらの因子が相互作用しながらOsterix遺伝子の発現を制御している可能性が考えられる。MC3T3-E1細胞において、共免疫沈降実験を行ったところMATIIとSmad3は相互作用していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
注目する標的遺伝子をOsterix遺伝子に変更したため、計画の調整、条件検討に時間を要した
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| Strategy for Future Research Activity |
1.Smad3がOsterix遺伝子転写調節制御領域に動員されているか検証：Smad3がOsterix遺伝子を直接制御しているかは不明である。MC3T3-E1細胞において、クロマチン免疫沈降（ChIP）実験により、Osterix遺伝子転写調節領域へのSmad3の動員があるか検証する。
2.Smad3がOsterix遺伝子転写制御領域のヒストン修飾に関与しているか検証：MC3T3-E1細胞において、Smad3がOsterix遺伝子制御領域のヒストン修飾に関与しているかは不明である。この細胞においてSmad3をノックダウンし、クロマチン免疫沈降（ChIP）実験によりOsterix遺伝子上のヒストン修飾状態をコントロールと比較、検証する。MC3T3-E1細胞からクロマチン分画を抽出し、転写抑制の指標であるH3K9me2修飾について調べる。
3.Setdb1およびSuv39h1がOsterix遺伝子の発現を抑制しているか検証：抑制性のヒストンメチル基転移酵素Setdb1およびSuv39h1はOsterix遺伝子の発現を抑制しているか検証する。Setdb1、Suv39h1ノックダウンおよびコントロールの骨芽細胞からmRNAを抽出し、定量PCRを用いてOsterix遺伝子の発現量をコントロールと比較する。
4.Smad3とSetdb1が相互作用しているか検証：Smad3とSetdb1は相互作用しANXA2遺伝子を抑制している報告がある（Pei et al.Cancer Res,2014）。これらの因子が相互作用しながらOsterix遺伝子の発現を制御している可能性が考えられる。MC3T3-E1細胞において、これらのタンパク質を過剰発現し共免疫沈降実験を行い、相互作用があるか検証する。
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