VEGF/VEGFRに着目した咬合刺激低下歯の効率的な矯正学的移動システムの構築

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K20582
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 臼見 莉沙 東京医科歯科大学, 歯学部附属病院, 医員 (90706946)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 咬合機能低下歯 / 歯科矯正 / LIPUS

Outline of Annual Research Achievements

これまでわれわれはラット臼歯の咬合刺激を低下後、矯正力を用いて移動する実験系において、咬合刺激の低下が歯根膜における退行性変化をもたらし、咬合刺激低下歯を矯正力を用いて移動した場合、正常咬合歯とは異なる移動様相を呈しCD31、VEGF-AおよびVEGFR-2の発現に影響を与えることを明らかとしてきた。さらにVEGFR-2陽性細胞が、矯正力による違いや、組織障害、またその修復過程に与える影響について詳細な検討を行っている。
そこで本研究では以下の①分子生物学手法を用いたVEGF依存性VEGFR-2誘導に着目した歯根膜細胞の賦活化②咬合刺激低下歯に対する効率的な矯正学的移動システムの構築
という2点について細胞培養実験および疾患動物モデルを用いて研究計画を立案した。
②についてLIPUSの効果を検証するため、12週齢の雄性Sprague-Dawleyラットをそれぞれ、正常咬合群（N群、n=5）、咬合刺激低下群（H群、n=5）、咬合刺激低下及びLIPUS照射群（HL群、n=5）に分類した。H群およびHL群については4週間bite plateを使用し臼歯の咬合刺激低下を行った。HL群にのみbite plate装着2週間後から毎日20分間LIPUSを照射した。マイクロCT解により、上顎第一大臼歯（M1）領域における歯槽骨の骨形態計測を行った。統計解析はTukeyの多重比較検定を用いた。 H群において、骨密度（Bone volume/ Tissue volume）は有意な減少を示したが、HL群、N群間で有意差はなかった。骨梁幅と骨梁数について、群間で有意差は認められなかった。骨梁間隙は、H群で有意な増加を示したが、HL及びNの群間に有意差はなかった。また、骨構造の異方性（MIL）について、H群にて有意な減少を示した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

歯の移動開始後 3～7 日にかけては、VEGF-1 ならびに VEGFR-2 は CD31 陽性細胞だけでなく他の歯根膜細胞にも発現が認められ、経時的に増加し、組織再生・修復過程への関与が疑われた。そこで、歯根膜細胞における VEGF-A による VEGFR-2 の発現誘導について、平成 27 年度には分子生物学手法を用いた VEGF 依存性 VEGFR-2 誘導に着目した歯根膜細胞の賦活化を予定しており、不死化歯根膜クローン細胞の作製を予定していた。
歯根膜はさまざまな細胞の集合体であることから、これまで初代培養の歯根膜細胞を用いた研究では、歯根膜サンプルや実験によって、安定した実験データを得ることが困難となり、1）歯根膜クローン細胞株の必要性、2）継代数による細胞特性の変化という実験上の課題があった。そこで本研究のために、人為的にヒト・テロメラーゼ遺伝子（hTERT 遺伝子）を安定発現させた不死化歯根膜細胞クローン細胞をはじめに作製することとした。
しかし、安定した培養条件がそろわなかったため、平成28年度～29年度に計画していた、咬合刺激低下歯に対する効率的な矯正学的システムの構築を先に検討することとした。
ラット咬合刺激低下歯に対するLIPUSの効果を検討するため、ラット臼歯咬合刺激低下モデルを用いてラット歯周組織の廃用性萎縮をおこしたのち、2週間のLIPUS照射に対する歯槽骨の変化を観察した。現在マイクロCTによる解剖学的変化の観察を行ったが、今後VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 および CD31 等の各種の血管新生因子および血管標識因子、フリーラジカル、炎症性サイトカイン、TUNEL 染色などの免疫組織学的解析、リアルタイム PCR によるメッセージレベルでの発現量の定量化や、イムノブロッディング法によるタンパク質レベルでの発現量の評価を予定している。

Strategy for Future Research Activity

現在行っているラット咬合刺激低下歯に対するLIPUS照射による歯周組織の賦活化が明らかとなったのち、10gfのTi-Niコイルスプリングを用いた咬合刺激低下歯の実験的移動へLIPUS照射が与える影響を検討する。歯の移動開始後 1, 2, 3 および 7 日後での変化について矯正学的移動量、VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2 および CD31 等の各種の血管新生因子および血管標識因子、フリーラジカル、炎症性サイトカイン、TUNEL 染色などの免疫組織学的解析、リアルタイム PCR によるメッセージレベルでの発現量の定量化や、イムノブロッディング法によるタンパク質レベルでの発現量の評価を行う。また、矯正力の検討を行うため、2gfのコイルスプリングを用いて同様の実験を行うこと、リカバリーモデルとしてラット臼歯咬合刺激低下後、上顎切歯に装着した咬合板と下顎切歯に装着した金属冠を除去し咬合刺激を再開させた群と咬合刺激を低下させたまま、2gf/10gf の矯正力を間欠的に与えた群を作製し比較検討を行うことで咬合刺激低下歯に対する効率的な矯正学的移動システムの構築を行うことを予定している。
現在培養条件の検討を行っている不死化歯根膜クローン細胞の作製をすすめ、不死化歯根膜クローン細胞を、VEGF-A を添加した条件で培養し、LIPUS を照射した際のクローン細胞における VEGFR-2 の発現量の経時的変化と、細胞分化の過程について検討する。方法としては、蛍光抗体法による培養細胞における VEGFR-2 の免疫染色と、リアルタイム PCR による mRNA の発現量の定量化や、イムノブロッディング法によるタンパク質の発現量の評価を行うことを予定している。

Research Products

• [Presentation] Effect of low-intensity pulsed ultrasound on periodontal tissues in occlusal hypofunctional teeth (2016)
  • Author(s): Yuki Kasahara, Risa Usumi-Fujita, Jun Hosomichi, Sawa Kaneko, Yuji Ishida, Naoki Shibutani, Yasuhiro Shimizu, Asuka Okito, Shuji Oishi, Yoichiro Kuma, and Takashi Ono.
  • Organizer: 38 Annual Scientific Conference on Dental Research
  • Place of Presentation: Vietnam・Ho Chi Minh City
  • Year and Date: 2016-04-04 – 2016-04-05
  • Int'l Joint Research