Porphyromonas gingivalis is involved in the detachment and aggregation of Aggregatibacter actinomycetemcomitans biofilm.

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K20623
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 原口 晃 九州大学, 大学病院, 助教 (00734998)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: Porphyromonas gingivalis

Outline of Annual Research Achievements

前年度研究計画でるAa凝集阻害するPgの培養上清中のプロテアーゼの同定について以下のように実験を進行してきた。
１）各株のPg培養上清に対してイオン交換クロマトグラフィを行い、採取したフラクションごとにAaの凝集阻害試験を行った。各フラクションごとに凝集阻害試験を行った結果、ジンジパインの含まれるフラクションは凝集を阻害したが、それ以外にも凝集阻害するフラクションがあることが確認された。
２）Aaバイオフィルムに対して凝集阻害効果のあった各フラクションを収集し、フラクション内のタンパクに対して二次元電気泳動を行った。さらにスポット解析を行った結果、阻害剤を入れたPg培養上清と比較できるスポットを多数発見できた。
３）２）のタンパクをBLASTのProtein query vs. translated database (tblastn) にかけ、アミノ酸配列を入力して解析を行い、アミノ酸配列に置換したときに相同性の高い塩基配列を検索し、検索結果に基づき、Natural Transformationによる遺伝子組換えを行い、選択された遺伝子の欠損株を作製している途中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成２７年度の予定としていた4つの項目について、１）各株のPg培養上清に対してイオン交換クロマトグラフィを行い、採取したフラクションごとにAaの凝集阻害試験、２）各フラクション内のタンパクに対して二次元電気泳動については問題なく行うことができた。Pg培養上清に対する阻害剤を用いての凝集阻害実験で特定のタンパクを抽出することができた。ジンジパイン以外の因子による凝集阻害の可能性について明確にすることができた。前年度は予定されていた３）選択された遺伝子の欠損株作成途中であるが、今後の実験も問題なく遂行できるものと考える。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度の実験計画である遺伝子欠損株による剥離凝集阻害実験と、当初の平成28年度の計画としてあげていた通り、以下の計画を遂行していく。
１）Aa ATCC29523株の菌体と、付着阻害及び、凝集阻害された菌体をそれぞれ二次元電気泳動ディファレンシャルディスプレイ解析により、標的タンパク質の発現量の増減をイメージング解析で比較検討し、デンシトメトリック解析によって定量化し、標的タンパク質を同定する。２）ATCC29523株を用いてNatural Transformationによる遺伝子組換えを行い、選択された遺伝子の欠損株を作製する。３）変異株を用いて、付着、凝集因子の喪失を確認する。

Causes of Carryover

前年度の実験計画について２）のタンパクをBLASTのProtein query vs. translated database (tblastn) にかけ、アミノ酸配列を入力して解析を行い、アミノ酸配列に置換したときに相同性の高い塩基配列を検索し、検索結果に基づき、Natural Transformationによる遺伝子組換えを行い、選択された遺伝子の欠損株を作製する途中であり、実験が予定されていた４）まで達していないため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

前年度の実験計画について選択された遺伝子欠損株の作成が現在進行中であり、その実験以降に必要となる消耗品等の経費を次年度に使用する。