2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K20985
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
小林 勇気 東京工業大学, 資源化学研究所, 助教 (80644616)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 植物ホルモン / アブシジン酸 / テトラピロール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物ホルモン・アブシジン酸（ABA）の藻類における機能やシグナル伝達機構における知見は少ない。そのため、進化的なABA獲得の背景は謎である。申請者は、最も原始的な植物である紅藻Cyanidioshyzon merolae（シゾン）にもABAが存在し、細胞周期を停止させることで高塩濃度環境での生存性を高めていることを明らかにしている。しかし、ABAシグナル伝達機構は不明である。本研究ではシゾンにおけるABAシグナル伝達機構を明らかにすることを目的とし研究を行った。申請者はシゾンゲノム解析の結果から、シゾンでも高等植物と類似したABAシグナル伝達機構を持っているのではないかと、仮説を立て証明を行った。本研究では1)高等植物でABAシグナル伝達の中心的役割を果たすPP2C・SnRK2によるABA伝達機構の生化学的な証明、2)ABA受容体の探索、3)転写因子の特定、4)プロモーターの同定と機能解析、5)モデルの検証、の5つの小目標を置き研究遂行を目指している。上記5つの内、1, 3, 4について、27年度で一定の成果を得ることが出来た。1)シゾンには4種のPP2Cと1種のSnRK2が存在している。これらのアンチセンス株と過剰発現株を作製しABA応答する遺伝子を指標に、ABA応答が不全になったものを選別した。その結果、PP2C2, PP2C3とSnRK2がABAシグナル伝達に関わっていることが明らかになった。3)ABA応答型転写因子候補遺伝子に対して、アンチセンス株を作製したところ、bZIP2のアンチセンス株でABA応答が阻害された。このことからbZIP2がABA応答型転写因子であることが示唆された。4)bZIP型転写因子はヘテロダイマーを形成して転写制御を行っていることが知られている。そこで4種すべての組換えbZIPタンパク質を精製し、ABA応答しているTSPO遺伝子プロモーターへの結合を確かめた。bZIP1とbZIP2の組み合わせでのみTSPOプロモーターへの結合が確認できた。また、同様の方法で結合領域を特定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では1) PP2C・SnRK2によるABA伝達機構の生化学的な証明、2)ABAレセプターの探索、3)転写因子の特定、4)プロモーターの同定と機能解析、5)モデルの検証、の5つの小目標を置き研究遂行を目指している。上記5つの内、1, 3, 4について、27年度で一定の成果を得ることが出来た。これらの成果は、藻類でも高等植物と非常に類似した機構によってABAシグナル伝達が制御されている事を示している。27年度の成果によって、ABAシグナル伝達に必要なコア因子の内、受容体以外の因子は同定できたと考えられる。さらに成果の一部を論文化し発表することも出来た。上記の理由から目的の達成度は6割以上と考えられ、研究目的に対する本年度の進捗状況は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
27年度の成果によりABA受容体以外のコア因子は特定することが出来た。28年度はABA受容体の探索を中心に、ABAシグナル伝達に関わる各因子の相互作用を詳しく検証していく。ABA受容体の探索に関しては、質量分析による探索を行ってきたが、細胞内で発現量の多い特定のタンパクがノイズになり良好な結果が得られなかった。これを打開するため、ノイズになるタンパクの抗体を作製し、抽出液から除くことで検出感度を高め同定を行う予定である。また、モデルの検証として特定した因子に関してはtagを付加した形質転換体を作製した。タンパクレベルでの発現量の測定や免疫沈降のために抗体を作製したが力価や特異性の面で良好な抗体が得られていなかった。そこでゲノム上の遺伝そのものをtagとの融合遺伝子に置き換えた形質転換体を作製した。従来はゲノムに新たに挿入することでtag融合タンパク質を細胞内で発現させていたが、遺伝子ごと置き換えることが可能になった。これにより、特異的な抗体を作製しなくてもタンパク量の定量が行えるようになった。また、内在性タンパクとの競合もなくなり、より正確な実験を行える。tagによる免疫沈降やリン酸化の検証を行い、生化学的な各因子の性質を詳しく解析する予定である。
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