細胞骨格制御によるミトコンドリア品質維持機構の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K21055
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 近藤 豪 浜松医科大学, 医学部, 特別研究員(PD) (10712705)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 細胞骨格 / ミトコンドリア / パーキソニズム

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリアの機能維持においてγ-tubulinが果たす役割を明らかにする目的で神経系に特異的に発現しているTUBG2遺伝子の機能解析を進めた。
TUBG2KOマウスに見られるミトコンドリア異常を詳細に評価するため、電子顕微鏡による神経細胞の観察を行なったところ、ミトコンドリアの形態異常と微小管の減少を認めた。また初代培養神経においてATP産生能の低下も認めた。よってTUBG2KO神経におけるミトコンドリアは形態だけではなく機能的にも異常であると考えられる。
免疫沈降-質量分析による予備検討においてミトコンドリアの分裂・融合に関わるタンパク質をTUBG2結合分子として同定していたため、培養細胞に両者を共発現させたが、タンパク質同士の相互作用ならびに細胞内共局在は認められなかった。よって予備検討の結果は、おそらく抗体の非特異的結合によるものと思われた。そこでTUBG1との分子的性質の違いをより明らかにするために、TUBG1、TUBG2をそれぞれ培養細胞に発現させて結合タンパク質をLC-MSで網羅的に探索、比較した。その結果TUBG2特異的に結合するタンパク質としてミトコンドリアに関連した複数の分子を新たに同定し、そのうちミトコンドリアの機能維持への関与が報告されている分子について上記再構成系でも結合を確認した。
ブレインバンクから提供されたパーキンソン病と多系統萎縮症におけるγ-tubulinの発現量を解析した。パーキンソン病患者ではγ-tubulinの異常を認めなかったが、多系統萎縮症では顕著な減少を認めた。よって多系統萎縮証におけるパーキンソニズムにγ-tubulinの異常が関与する可能性が示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予備検討で得られていた結果をもとにTUBG2KOマウスの細胞生物学的解析を進め、神経細胞における細胞骨格とミトコンドリアの異常を確認した。さらに生化学的な実験手法により、上記の異常と関係性が疑われるTUBG2結合タンパク質を同定した。これらの結果から神経系におけるTUBG2遺伝子の役割が細胞および分子レベルで明らかになりつつある。またヒトの疾患サンプルにおいて発現量に異常が見られたことから、疾患の発症メカニズムにTUBG2遺伝子が寄与する可能性が示唆された。以上のことから細胞骨格分子とミトコンドリア機能との新たな機能的関係性が認められ、プロジェクトは順調に進んでいると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後は再構成実験により分子メカニズムの解明を進める。特に新たに同定したTUBG2結合分子が、TUBG2遺伝子の欠損によりどのような影響を受けるかを確認し、認められた異常を補正することでミトコンドリア機能が回復するかを検証する。予備検討の結果から当初はミトコンドリアの分裂・融合制御とマイトファジーへの関連を疑い研究計画を立てていたが、その後の実験結果からは少し違う分子メカニズムが想定される。適宜計画を修正して実験を行ない、論文作成を進める。

Causes of Carryover

平成27年度交付された直接経費900,000円のうち28,358円を次年度使用とした。理由は研究の遂行上、新年度に入ってすぐ必要な試薬類が生じる場合が考えられ、平成２８年度分の交付前であっても対応できるようにするためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成２８年度初頭に実験上必要な試薬類の購入に当てる。DNAオリゴ合成サービスや細胞培養関連試薬の購入が主な用途なる予定である。