2015 Fiscal Year Research-status Report
誘導型ユビキチンリガーゼSSBによるEphrin受容体の機能制御
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15K21056
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
奥村 文彦 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (00507212)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ユビキチン / Eph / SSB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
SOCSボックスタンパク質としてCIS/SOCSファミリーが知られている。それらはサイトカインシグナル伝達を抑制し、過剰な免疫反応が起きないようにしている。一方でSOCSボックスをもつSSBファミリー（SSB-1, 2, 3, 4）はその機能が分かっていない。われわれはSSBファミリーの新規結合分子として細胞膜受容体Ephを同定した。Ephは細胞の種類によりガン遺伝子あるいはガン抑制遺伝子として機能していることが知られており、SSBによるEphの制御がどのような生理的役割を担っているのかを明らかにすることを目的としている。
本年度は①過剰発現系あるいはノックダウンによりSSBのタンパク質量を制御し、Ephの安定性をシクロヘキシミドチェイス実験などにより評価する②in vivoやin vitroにおいてユビキチン化反応をおこない、SSB依存的なEphのポリユビキチン化を確認することなどを目的とした。
Ephの細胞内ドメインとSSBをHEK293T細胞に発現させ、Ephのユビキチン化を比較検討した結果、SSB依存的なEphのユビキチン化を確認することができた。また、Ephの細胞内ドメインがプロテアソーム阻害剤依存的に蓄積することも確認した。さらに、内在性のSSBのノックダウンによりEphの細胞内ドメインが安定化することを確認した。内在性のEphと過剰発現したSSBとの結合が確認できたので、EphはSSBによってユビキチン修飾依存的に分解制御されていることが示唆される。一方でSSBの過剰発現によるEphの発現量の変化はみられなかった。このことは内在性のSSBで必要十分である可能性を示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
過去の報告から予想されたSSBのユビキチンリガーゼとしての機能を確認でき、新規に同定した基質候補であるEphとの結合や、ユビキチン化などを示すことができているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予測、研究計画に即したデータをおおむね得ることができているので、今後も申請した研究計画に沿って実験を行う。すなわち、SSBによるEphの発現制御が細胞間シグナル伝達に及ぼす影響を過去の報告に従い明らかにする事を目的とする。①SSBが生理的なリガンドEphrin刺激により発現誘導されるかを検討する。②過去の報告に従い、大腸がん細胞株Colo201の内在性SSBをノックダウンし、細胞の増殖速度、ガン細胞の浸潤能などを比較評価する。
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| Causes of Carryover |
試験管内ユビキチン化反応を行う予定であったが、まだ実施できていない。今後大腸菌発現用のプラスミドを構築し、各タンパク質を大量精製し行う予定であるため。また、ユビキチンリガーゼ複合体は昆虫細胞を用いて大量精製する予定である。
細胞遊走能の評価ができていないので、キットを購入し評価する予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
タンパク質を大量精製するための試薬、培地、キットの購入に充てる。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Parallel regulation of VHL disease by pVHL-mediated degradation of B-Myb and HIF-alpha2016
Author(s)
Okumura, F., Uematsu, K., Byrne, S.D., Hirano, M., Okumura, A. J., Nishikimi, A., Shuin, T., Fukui, Y., Nakatsukasa, K. & Kamura, T.
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Journal Title
Mol. Cell. Biol.
Volume: N/A
Pages: N/A
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] The Ubiquitin Ligase SCF(Ucc1) Acts as a Metabolic Switch for the Glyoxylate Cycle2015
Author(s)
Nakatsukasa, K. , Nishimura, T., Byrne, S. D., Okamoto, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Chibana, H., Okumura, F. & Kamura, T.
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Journal Title
Molecular Cell
Volume: 59(1)
Pages: 22-34
DOI
Peer Reviewed
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