2015 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子組換えイバラキウイルスを用いた二本鎖RNAウイルス感染・複製機序の解明
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15K21152
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
松尾 栄子 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (40620878)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 標識IBAV / FACS解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、IBAVの侵入機構の解明のため、外殻と内殻をそれぞれ標識したIBAV（DL-IBAV）作製方法として、予定していた3種の方法のうち２つの方法を試みた。まず、テトラシステインタグ（TC-tag）を組込んだVP6（TC-VP6）をもつTC-IBAVの外殻（VP2）に存在するシステインと、 粒子内部のTC-VP6をそれぞれ異なる波長の蛍光色素で標識する方法では、内部のTC-VP6を標識することはできなかった。一方、蛍光タンパク質を組込んだVP6をもつ遺伝子組換えIBAVの外殻に存在するシステインを組込んだ蛍光タンパク質とは波長の異なる蛍光色素で標識する方法では、IBAV粒子の外殻を赤色蛍光色素、内殻をVP6遺伝子であるS9にEGFP遺伝子を組込む（S9-EGFP）ことで緑色に標識することが出来た。その増殖性は野生型のIBAVよりも悪いが、細胞への侵入を可視化することは可能であった。しかし、S9-EGFPは、本来のS9よりもゲノムサイズが大きいため、継代によってEGFPを欠失してしまうことが分かった。そこで、H24~H25年度に採択された科研費の研究において明らかとなったVP6のVP3結合領域を欠損させた変異IBAVを、EGFPを組込んだ機能的なVP6（EGFP-VP6）を恒常的に発現するヘルパー細胞で増殖させることで、EGFP-VP6をIBAV粒子中に取り込ませることに成功した（IBAV-EGFPdrep）。このIBAV-EGFPdrepの細胞への吸着はIBAV中和抗体によって阻害された。また、その吸着率をFACS解析により数値化することに成功した。次に、様々なマーカー遺伝子を組込んだS9をもつIBAVをFLAG-tagやEGFPを組込んだVP6を発現するヘルパー細胞で増殖させ、2種類のマーカーとそれぞれ融合したVP6が混在したVP6多量体をもつIBAVを作製できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DL-IBAVの作製に予想以上に時間がかかってしまったため、Live cell imagingを年度内に行うことはできなかったが、FACSを用いたIBAVの細胞への吸着を数値化する系を新たに開発することができた。これは今後IBAVを含むオルビウイルスを研究する上で大きな進歩であると考えられる。また、EGFP-VP6を発現するヘルパー細胞を作製する過程や、2種類のマーカーとそれぞれ融合したVP6が混在したVP6多量体をもつIBAVを作製する過程で、VP6に関する新たな知見を得ることができた。よって、本年度の研究はおおむね順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
H28年度はまず、DL-IBAVの性状解析をさらに進めるとともに、Live cell imagingを用いた、BHK細胞、NMuLi細胞へのIBAVの吸着・侵入過程の解析に着手する。同時に、FACS解析で顕微鏡観察では差があると見られたBHK細胞とNMuLi細胞へのIBAVの吸着率の差を数値化することで確かめる。さらに、IBAVタンパク質合成・抑制に関わる宿主因子の探索を始める予定である。
IBAVタンパク質合成に関わる因子として、eIF4Eなど主要な翻訳開始因子に着目して実験を進める。IBAVタンパク質の抑制に関しては、自然免疫に関わる因子ならびにオートファージ関連因子について調べる。
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