2015 Fiscal Year Research-status Report
心肥大・心不全時におけるGATA4ホモ二量体形成の機能解析
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15K21279
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
砂川 陽一 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (30466297)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 転写因子 / 二量体化 / 心肥大 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は心不全発症メカニズムを解明するために、心筋細胞肥大の情報伝達経路を詳細に検討し、心筋特異的転写因子GATA4及びそのアセチル化が心筋細胞肥大が重要な役割を果たしていること(p300/GATA4経路)、さらにp300特異的阻害剤であるクルクミンがGATA4のアセチル化阻害を介して心肥大を抑制し、心不全の進展を抑制することを見出した。また、肥大反応因子の転写活性化にはGATA4のアセチル化だけでなく、GATA4のホモ二量体形成も関与していること、この二量体化形成にはp300によるGATA4のアセチル化が重要なプロセスであることを見出した(未発表データ)。このようにGATA4はp300をはじめとした様々な因子と複合体を形成するだけでなく、ホモ二量体することで、その転写反応及び心筋細胞肥大を制御していると考えられる。
そこで、本研究ではGATA4のホモ二量体化形成がどの部位で行われているのか決定し、その部位を中心とした立体構造情報を得ること、翻訳後修飾を介してどのようにGATA4のDNA結合能や転写活性化と関与しているのかを明らかにすること、そうして得た知見を基に化合物をスクリーニングすることで、GATA4のホモ二量体化形成をターゲットとした、より根本的で特異性の高い心不全治療への応用を目指すことを目的とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GATA4にはN端とC端に転写活性化ドメイン、中央部に二つのZinc Fingerドメイン (N-ZF、C-ZF) と核移行ドメインが存在している。この内、2つZinc FingerドメインはDNA結合能を有しており、GATAファミリー間で高度に保存されている。またGATA1はN-ZFとC-ZFが二量体形成に関与していると報告されている。GATA4のどのドメインがホモ二量体化形成に寄与しているのか調べるために、様々な部位欠損GATA4変異体にGSTタグを付与したリコンビナントタンパクを作成し、in vitro プルダウンアッセイを行った。その結果、GATA4の二量体化形成はC-ZFの直後に位置する部位が必須であることが判明した。また、作製した変異体のDNA結合能を検討したところ、二量体化に必須の部位を欠失させると二量体化能を失うことが判明した。この部位はp300によるアセチル化をうける4つのリジンを含んでおり、GATA4のアセチル化がDNA結合能だけでなく二量体化形成にも深く関与していることが裏付けられた。
GATA4のZinc Fingerドメインの結晶構造解析を行うため、リコンビナントN+C-ZFとC-ZFの精製を行った。アフィニティカラム精製、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラムに供することで高純度のタンパクを得ることが出来た。現在、これらタンパクを用いて結晶化条件の検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、引き続きGATA4の二量体化形成の結晶化条件の検討を行い、成功すれば立体構造に基づいた解析を行う予定である。また、GATA4の二量体化部位がどのようにGATA4のアセチル化や転写活性化に重要な役割を果たしているのか調べるため、二量体化能欠損GATA4を作成し、培養心筋細胞での心肥大反応を調べる予定である。
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