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2016 Fiscal Year Research-status Report

心肥大・心不全時におけるGATA4ホモ二量体形成の機能解析

Research Project

Project/Area Number 15K21279
Research InstitutionUniversity of Shizuoka

Principal Investigator

砂川 陽一  静岡県立大学, 薬学部, 助教 (30466297)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords転写因子 / 心肥大 / GATA4 / p300 / 二量体
Outline of Annual Research Achievements

心不全の発症・進展には心臓特異的転写因GATA4が重要な役割を担っている。本年度では心筋細胞肥大に対しGATA4の二量体形成がどのように関与しているか検討した。
HEK293T細胞にFLAGタグを付与したGATA4を発現させ、グルタルアルデヒドによる架橋反応を行ったところ、GATA4の二量体化はp300を共発現させると増強した。HEK293T細胞でのIP-WBでは、p300とGATA4を共発現させるとGATA4のアセチル化とともに二量体形成が増加していた。GATA4アセチル化部位欠失変異体やp300HAT活性欠失変異体の場合、GATA4のアセチル化も起こらず、二量体化形成の増加も見られなかった。同定した二量体形成部位を3つタンデムに繋げた変異体(3xG4D)を発現させるプラスミドを作成し、HEK293T細胞に過剰発現させたところ、GATA4のアセチル化量は変化させずに二量体形成及び心肥大反応遺伝子であるANF、ET-1のプロモーター活性を抑制していた。最後に初代培養心筋細胞に3xG4Dをレンチウイルスを用いて過剰発現させたところ、フェニレフリンによって誘導される心筋細胞肥大反応が有意に抑制された。
GATA4の二量体化部位に必須のドメインである308-326部位とDNA結合能に必須であるZinc Finger部位の立体構造解析を行うため、これらの部位を含むGATA4断片を大腸菌にて作成し、各種クロマトグラフィにより精製を行った。これをGATA配列を含むDNAと混合し、結晶化スクリーニング、結晶化条件の最適化を行い、X線回折実験に適した結晶を得ることに成功した。得られた結晶を用いて、Photon Factory BL17AにてX線回折実験を行い、タンパク結晶特有の回折像を得た。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

GATA4の二量体化部位とZinc Finger部位のタンパク結晶化のスクリーニングを行い、タンパク結晶特有の回折像を得たが、最終的に立体構造を決定するまでには至らなかった。そのため、結晶化されるたんぱく質の長さや混合するDNA配列を変更し、網羅的に結晶化条件と再検討することで、二量体化部位とZinc Finger部位の立体構造の特定まで持っていきたい。

Strategy for Future Research Activity

本研究結果により、GATA4の二量体化形成が転写コアクチベーターであるp300のHAT活性により制御を受けていること、3xG4DによりGATA4の二量体化形成を特異的に阻害すると心筋細胞肥大反応が抑制されることを見出した。このことから、GATA4の二量体化形成が心不全治療の新たな標的となる可能性が示唆された。そこで、GATA4の二量体化形成を指標としたハイスループットの検出方法の確立を試みている。この手法が確立できたならば、GATA4の二量体化を阻害する化合物のスクリーニングを行うことが可能となる。また、この検出方法をマウスに導入することで、肥大や不全心でのGATA4二量体化形成の変化について詳しく検討していく予定である。

  • Research Products

    (10 results)

All 2017 2016

All Presentation (10 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results)

  • [Presentation] 心肥大反応に関わるGATA4のZF部位のX線結晶構造解析2017

    • Author(s)
      清水聡史、原幸大、砂川陽一、刀坂泰史、和田啓道、長谷川浩二、森本達也
    • Organizer
      日本薬学会第137回年会
    • Place of Presentation
      東北大学 他
    • Year and Date
      2017-03-24 – 2017-03-27
  • [Presentation] The dimerization domain of GATA4 is involved in the activation of hypertrophic response2017

    • Author(s)
      Satoshi Shimizu, Natsumi Yorimitsu, Yoichi Sunagawa, Masafumi Funamoto, Yasufumi Katanasaka, Hiromichi Wada, Koji Hasegawa, Tatsuya Morimoto
    • Organizer
      第81回日本循環器学会学術集会
    • Place of Presentation
      石川県立音楽堂 他
    • Year and Date
      2017-03-17 – 2017-03-19
  • [Presentation] 心不全に関わる転写因子GATA4の結晶構造解析2017

    • Author(s)
      清水聡史、原幸大、砂川陽一、刀坂泰史、和田啓道、長谷川浩二、橋本博、森本達也
    • Organizer
      量子ビームサイエンスフェスタ
    • Place of Presentation
      つくば国際会議場
    • Year and Date
      2017-03-14 – 2017-03-15
  • [Presentation] Homo-dimerization of GATA4 is formed through C-terminal zinc finger domain2016

    • Author(s)
      Satoshi Shimizu, Natsumi Yorimitsu, Yoichi Sunagawa, Masafumi Funamoto, Yasufumi Katanasaka, Hiromichi Wada, Koji Hasegawa, Tatsuya Morimoto
    • Organizer
      International Society of Cardiomyopathies and Heart Failure 2016
    • Place of Presentation
      京都国際会館
    • Year and Date
      2016-12-02 – 2016-12-04
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Acetylated form of GATA4 is required for GATA4 homo-dimerization2016

    • Author(s)
      Satoshi Shimizu, Natsumi Yorimitsu, Yoichi Sunagawa, Masafumi Funamoto, Yasufumi Katanasaka, Hiromichi Wada, Koji Hasegawa, Tatsuya Morimoto
    • Organizer
      第21回静岡健康長寿学術フォーラム
    • Place of Presentation
      グランシップ静岡
    • Year and Date
      2016-11-25 – 2016-11-26
  • [Presentation] Homo-dimarization domain of GATA4 involved in p300/GATA4-dependent hypertrophic gene activations2016

    • Author(s)
      Natsumi Yorimitsu, Satoshi Shimizu, Yoichi Sunagawa, Masafumi Funamoto, Yasufumi Katanasaka, Hiromichi Wada, Koji Hasegawa, Tatsuya Morimoto
    • Organizer
      第21回静岡健康長寿学術フォーラム
    • Place of Presentation
      グランシップ静岡
    • Year and Date
      2016-11-25 – 2016-11-26
  • [Presentation] Overexpression of GATA4 dimerization domain inhibited p300/GATA4-dependent hypertrophic genes transcription2016

    • Author(s)
      Natsumi Yorimitsu, Satoshi Shimizu, Yoichi Sunagawa, Masafumi Funamoto, Yasufumi Katanasaka, Hiromichi Wada, Koji Hasegawa, Tatsuya Morimoto
    • Organizer
      The 3rd International Conference on Pharma-Food (ICPF 2016)
    • Place of Presentation
      日本平ホテル
    • Year and Date
      2016-11-17 – 2016-11-18
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Acetylation of GATA4 is required for the formation of GATA4 Homo-dimerization2016

    • Author(s)
      Satoshi Shimizu, Natsumi Yorimitsu, Yoichi Sunagawa, Masafumi Funamoto, Yasufumi Katanasaka, Hiromichi Wada, Koji Hasegawa, Tatsuya Morimoto
    • Organizer
      The 3rd International Conference on Pharma-Food (ICPF 2016)
    • Place of Presentation
      日本平ホテル
    • Year and Date
      2016-11-17 – 2016-11-18
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 心肥大反応を司る転写因子GATA4の二量体はC末のZFドメインで形成される2016

    • Author(s)
      依光奈津美、清水聡史、砂川陽一、刀坂泰史、和田啓道、長谷川浩二、橋本博、森本達也
    • Organizer
      日本病院薬剤師会東海ブロック 日本薬学会東海支部 合同学術大会2017
    • Place of Presentation
      長良川国際会議場
    • Year and Date
      2016-10-30 – 2016-10-30
  • [Presentation] 心筋細胞肥大に関与する転写因子GATA4はZincフィンガードメインで直接結合し、ホモ二量体を形成する2016

    • Author(s)
      清水聡史、依光奈津美、砂川陽一、刀坂泰史、和田啓道、長谷川浩二、橋本博、森本達也
    • Organizer
      日本病院薬剤師会東海ブロック 日本薬学会東海支部 合同学術大会2017
    • Place of Presentation
      阿波観光ホテル
    • Year and Date
      2016-06-25 – 2016-06-26

URL: 

Published: 2018-01-16  

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