Analysis of GATA4 dimarization during hypertrophic responses

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K21279
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 砂川 陽一 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (30466297)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: GATA4 / 二量体化 / 結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

心不全の発症・進展には心臓特異的転写因GATA4が重要な役割を担っている。本年度ではGATA4の二量体形成にp300のHAT活性がどの
ように関与しているのか、心筋細胞肥大とGATA4の二量体化形成、結晶構造解析について検討した。
精製GATA4をグルタルアルデヒドによる架橋反応を行ったところ、GATA4の二量体化が検出された。また、GATA4二量体化ドメインの場合、少なくとも4量体まで形成していた。HEK293T細胞でのIP-WBの結果、p300によるGATA4のアセチル化が二量体形成のキープロセスであり、p300のScaffold機能やBridging機能は関与していないことが判明した。同定した二量体形成部位を3つタンデムに繋げた変異体（3xG4D）を発現させるプラスミドを作成し、HEK293T細胞に過剰発現させたところ、GATA4のアセチル化は変化せずにGATA4の二量体形成及び心肥大反応遺伝子であるANF、ET-1のプロモーター活性を抑制した。最後に初代培養心筋細胞に3xG4Dをレンチウイルスを用いて過剰発現させた。共焦点顕微鏡にて3xG4Dが心筋細胞核内に局在しているところを確認した。免疫染色の結果、フェニレフリンによって誘導される心筋細胞肥大反応が有意に抑制された。
GATA4の二量体化部位に必須のドメインである308-326部位とDNA結合能に必須であるZinc Finger部位の立体構造解析を行った。GATA配列を含むDNAとの共結晶が得られ、結晶化スクリーニング、結晶化条件の最適化、X線回折実験を行った。その結果、3.1Åの解析像が得られた。現在、この結果を元に分子モデリングを構築中である。

Research Products

• [Presentation] Determination and crystallization of GATA4 dimerization domain spectrometry. (2018)
  • Author(s): Shimizu S, Hara K, Sunagawa Y, Hishiki A, Miyazaki Y, Katanasaka Y, Funamoto M, Sari N, Shimizu K, Wada H, Hasegawa K, Hashimoto H, Morimoto T.
  • Organizer: IUBMB Focused Meeting on GATA Transcription Factors,
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The Dimerization of GATA4 is Involved in Hypertrophic Responses in Cardiomyocytes (2018)
  • Author(s): ○Shimizu S, Yorimitsu N, Sunagawa Y, Katanasaka Y, Miyazaki Y, Funamoto M, Wada H, Hasegawa K, Morimoto T
  • Organizer: Asian Pacific Society of Cardiology Congress 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Dimerization domain of GATA4, a hypertrophy-responsive transcription factor is the therapeutic targets (2018)
  • Author(s): Shimizu S., Hara K, Sunagawa Y, Hishiki A, Funamoto M, Miyazaki Y, Katanasaka Y, Wada H, Hasegawa K, Hashimoto H, Morimoto T
  • Organizer: 第1回日本循環器学会基礎研究フォーラム
• [Presentation] 心肥大応答を司る転写因子GATA4の二量体形成・DNA結合部位の同定と結晶化 (2018)
  • Author(s): 清水聡史, 原幸大, 砂川陽一, 菱木麻美, 宮崎雄輔, 刀坂泰史, 船本雅文, Nurmila Sari, 清水果奈, 和田啓道, 長 谷川浩二, 橋本博, 森本達也
  • Organizer: 日本 薬学会第138年会,
• [Presentation] The dimerization domain of the hypertrophy-responsive transcription factor GATA4 is a therapeutic target for heart failure (2018)
  • Author(s): Shimizu S., Hara K, Sunagawa Y, Hishiki A, Funamoto M, Miyazaki Y, Katanasaka Y, Wada H, Hasegawa K, Hashimoto H, Morimoto T
  • Organizer: 第82回日本循環器学会学術集会