2017 Fiscal Year Research-status Report
非環式レチノイドによるオートファジー制御メカニズムの解析
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15K21310
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| Research Institution | University of Nagasaki |
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Principal Investigator |
岡本 恭子 長崎県立大学, 看護栄養学部, 助教 (40714853)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 癌の化学予防 / 細胞死誘導メカニズム / パイロトーシス / オートファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
医療用ハーブなどに天然に存在する栄養成分であり、イソプレン単位4個からなる非環式ジテルペノイドであるゲラニルゲラノイン酸（GGA）を利用した肝癌細胞の細胞死誘導において、そのメカニズムの作用点をヒト肝癌由来細胞株のHuH-7細胞を用いて、遺伝子発現の解析などによって解明しようとしている。
GGAの細胞死誘導メカニズにはオートファジー応答、ERストレス（UPR）などが関連していることを見出してきたが、この二つは本来細胞の生存に働く機構であり、GGAによる細胞死誘導ストレスがこの機構を上回る、あるいは応答が不完全であるため細胞死に至ると考えた。GGAが誘導する不完全なオートファジー応答は、オートファゴソームとリソソームの融合阻害ではないかと考え、その二つの細胞小器官の融合阻害に関与するRUBICONタンパクに着目し動態を検証した。HuH-7細胞へのGGA添加後RUBICONタンパクの増加により、その膜融合ができず、後期のオートファジーにみられる成熟したオートリソソームができないことが示唆され、GGAはオートファジーの不完全な応答を誘導し、エネルギー欠乏や障害された細胞内器官の異常蓄積を起こし、最終的に細胞死を誘導する可能性を見出すことができた。
また、HuH-7細胞へのGGA添加後の形態学的動態からパイロトーシスによる細胞死の可能性を新たに見出した。
そこで、CRISPR/Cas9法によって、オートファジー関連遺伝子のノックアウト細胞の作製および、TLR4ならびにTLR4と相互作用するCD36、CD14などのパイロトーシス関連遺伝子をノックアウトした細胞を用いることによって、GGAのパイロトーシス誘導にクリティカルな遺伝子をTLR4周辺で探索する研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度、本学科の4年生のチューターであり、本学は管理栄養士養成校であるため、4年生の管理栄養士の国家試験対策の業務が予想以上に多忙となっていた。国家試験対策は昨年9月ごろから本格化し、試験を迎える今年の3月まで続いていた。その間、通常よりも研究の進行が滞っていた。途中で作業を中断できないノックアウト細胞作成などは特に作業が滞ることが多かった。
また、CRISPR/Cas9法を用いた目的遺伝子のノックアウト細胞の作製が予定していたよりも時間がかかってしまい、昨年後半頃からからようやくノックアウト細胞を用いた研究が進行できるようになったが、オートファジーやパイロトーシス誘導の再現性を精緻に確認する必要があったため、そちらにも時間を割くと、物理的、身体的に時間が不足していた。
国家試験も終了し、現在は通常の研究体制に戻せており、再現性の確認などの滞っていた研究を進めている状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
作成したオートファジー関連遺伝子のノックアウト細胞とパイロトーシス関連遺伝子のノックアウト細胞を用いて、詳細なGGAによる細胞死誘導メカニズムの作用点を解明していきたいと考えている。これまでに見出してきた、HuH-7細胞へのGGA添加により誘導されるUPR、RUBICONタンパクが関連したオートファジーの不完全な応答、パイロトーシスなどのうち、いずれの誘導が細胞死に関与しているのか、また相互に関連して細胞死を誘導している可能性がないかを明らかにしていく。
また、以前から研究していたがん抑制遺伝子の一つであるp53タンパクの変異の影響について、作製したp53変異細胞株とp53野生型細胞株を用いて、p53と関与する遺伝子、タンパク質の変化を見出したものについて結果をまとめていく。
今後は近年利用できるようになった、ヒト正常肝細胞株へのGGA暴露実験により、正常細胞への細胞死を誘導しないかを検証していく予定である。
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| Causes of Carryover |
昨年度、本学科の4年生のチューターであり、本学は管理栄養士養成校であるため、4年生の管理栄養士の国家試験対策という研究以外の業務が予想以上に多忙となっていた。
当初予定していたノックアウト細胞の作製にも時間がかかっており、その間は新たに試薬の購入などがなかったため、予算の半分ほどの使用にとどまった。
使用計画としては、ノックアウト細胞を用いた細胞死誘導メカニズムの解明に係る、qPCR法を用いた遺伝子解析、ウエスタンブロット法による関連タンパクの変化などを解析するうえで、必要となる試薬の補充。また、研究成果をまとめた論文作成に係るネイティブチェックなどの費用に充てていく予定である。
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