単一細胞解析によるhiPSCからβ細胞への分化メカニズムの解明と分化効率向上化

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K21333
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 菅原 泉 埼玉医科大学, 医学部, 研究員 (10633000)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: β細胞 / single cell / hiPSダブルノックイン

Outline of Annual Research Achievements

ヒトhiPS細胞からβ細胞への分化誘導法は近年ようやくin vitro における成熟化に成功している例が見られる。しかし分化メカニズムはまだ不明な点が多く、特にヒトiPS細胞から分化させる際のβ細胞の成熟化に関するメカニズムはわかっていない。
従って本研究では分化メカニズムの解明を試みるためにダブル蛍光標識hiPS細胞を用いてβ細胞へ分化誘導をし、蛍光細胞のソーティングを行い単一細胞解析を行う。
【研究実施状況】グルコース応答性のある細胞を得て、単一細胞解析の実施に至ることができ、現在はデータの解析中である。本細胞はダブル蛍光標識hiPS細胞でありβ細胞分化をモニターすることが可能な細胞である。すなわちβ細胞のマーカーであるInsulin promoter の下流にVenus、更に内分分泌前駆細胞である　NGN3 promoter の下流にmCherry をノックインさせたダブル蛍光標識hiPS細胞（Ins-Venus/NGN3-mCherry)である。hiPS細胞から分化誘導をかけると内分泌細胞が出現するころに赤く光る細胞が出現し、内分泌細胞が出てくるころには緑に光る細胞が増えてくる。更に中間的な細胞として緑と赤の蛍光が同時に光る黄色い細胞も存在する。これらの細胞は時間と共に出現するが分化最終段階においてもそれぞれの細胞が存在している。したがって最終分化時にこれらの3グループの細胞をランダムにソーティングし、単一細胞解析を行った。今後はターゲット遺伝子群の検証を行い、グルコース応答性の細胞のプロファイルを明らかにすることで最終目的細胞の現状を把握し、その上で分化誘導の改善点なども見出されると思われる。更にターゲット遺伝子を誘導する化合物などをスクリーニングすることでより効率的に誘導を行えるものができると思われる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定では報告されているMeltonグループらのプロトコルを用いてグルコース応答性の細胞をソーティングし単一細胞の解析を行う予定でしたがプロトコルを完全に再現することができなかった。共同研究を行っていたグループでは独自のプロトコルを開発されグルコース応答性のある細胞を作ることに成功していることからそのプロトコルを採用した。したがって共同研究先の協力のもと分化誘導を行い、和光理研の二階堂研究室において、委託研究として実施した。したがって当初より予定していた解析を実施することができた。

Strategy for Future Research Activity

ダブル蛍光標識hiPS細胞はβ細胞分化のマーカーを挿入しており分化誘導時をモニターすることができる細胞である。β細胞のマーカーであるINS-promoter の下流にVenus, 内分泌前駆細胞のマーカーであるNGN3-promoter の下流にmCherry を挿入したものであり、最終分化段階においては、それぞれ β細胞は緑に、内分泌前駆細胞は赤に光る細胞となる。更にVenus および　mCherry が同時に発現している中間的な細胞群も存在する。本研究においては上記3郡をそれぞれランダムにソーティングし、単一細胞解析を 二階堂グループらによって開発された Quartz-seq の方法を用いて解析を行った。シングルセル解析において3種類の細胞群を同時に明らかにすることができる。β細胞においてはグルコース応答性のあるものとないもの、すなわち成熟または未成熟な細胞をプロファイルすることができ、更にNGN3+ 前駆細胞の性質も初めて明らかにすることが可能である。更にダブルポジティブ細胞においてはどのようにβ細胞となっていくかを解明できるのではないかと思われる。各郡の細胞種のプロファイリングを行うと共にそれぞれの群における個々の違いについて追及していく。新規の遺伝子については確認実験等を随時行っていく。更に単一成熟β細胞プロファイルが実際にグルコース応答性のある細胞であるかの確認を行っていく。必要に応じてターゲット遺伝子のスクリーニングを行い、更に高効率の質の高いβ細胞の作製を試みる。

Causes of Carryover

単一細胞解析を行うにあたり、細胞数を稼ぐ必要があったためまたシーケンス費用が高コストであり前倒しをする必要があった。しかしゲノム支援などのサポートもあり受託研究として実施することができたため最低限のコストで行うことができたため、差額が生じた。差額分は次年度の必要試薬に使用する予定である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

主にhiPS細胞のメンテナンスや、誘導培地、誘導因子サイトカインなどに使用する予定である。