2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K21489
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
中山 実 京都産業大学, 総合生命科学部, 研究助教 (40449236)
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2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ショウジョウバエ / アセチルコリン受容体 / シナプス間隙 / 分泌性タンパク質 / 細胞外マトリックス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ショウジョウバエ分泌性シナプス間隙タンパク質Higは、神経発生において細胞外へ分泌後、脳内に拡散し特定のシナプスに局在化する。Higのシナプス局在を制御する因子として、アセチルコリン受容体(AchR)以外に新規因子の存在が示唆されていた。本年度において、Higのシナプス局在化新規因子をHasp(Hig-anchoring scaffold protein)と命名し、その詳細を論文発表した。Haspは、Higと同様にシナプス間隙に局在する分泌性タンパク質であることを、免疫電顕により確かめた。Hasp変異体ではHigのシナプス局在が消失し、HaspとHigの両変異体では、AchRサブユニットDα6とDα7の減少が見られる。一方で、受容体の変異体（Dα6, Dα7二重変異体）ではHigのシナプス局在量は減少するものの、Haspのシナプス局在には影響が見られない。このことから、HaspはHigのシナプス局在を制御することで間接的に受容体局在制御に関与する一方で、Higはより直接的に受容体局在制御を行っていると考えられた。これらタンパク質複合体を解析するために免疫沈降実験を行ったところ、Dα6またはDα7によりHig（の断片）が共沈降するものの、Haspの共沈降は見られなかった。以上のように、二つのシナプス間隙タンパク質HigとHaspによるAchR集積のメカニズムの一端を明らかにすることができた。一方で、Dα6とDα7以外に、Dα5もまた、Higと遺伝的相互作用することがRNAi実験によりわかったため、Dα5ノックアウト個体の作製を進めた。CRISPR/Cas9システムを用いて複数のフレームシフト変異体の作製に成功したが、変異体脳においてDα5シグナルの消失が見られなかったため、新たなgRNAターゲットを設定し引き続きDα5ノックアウト系統の作製を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２７年度において、当初の予定であったHigと相互作用する新規因子Haspに関する論文の報告を行うことができた。このため、一定の成果をあげることができた。一方で、アセチルコリン受容体Dalpha5の変異体の作成を計画していたが、得られた系統ではDalpha5抗体染色によるシグナルの消失がみられず、欠失突然変異体になっていないと考えられた。これについては平成２８年度にさらに新たな系統を作成していく予定である。一部計画通りに進まない点もあるものの、全体的には、論文発表を行うなど順調に推移していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度の研究については、当初の計画通り進めていく予定である。アセチルコリン受容体Dalpha5の突然変異体の作成を引き続き行い、得られた変異体を用いて、アセチルコリン受容体とシナプス間隙タンパク質HigとHaspとの相互作用関係についての詳細をさらに調べていく。また、免疫沈降によりHaspと相互作用する因子の探索を進めていく。現在、予備的な実験によりいくつかの候補因子が同定されているが、これをさらに継続していく。以上により、中枢コリン作動性シナプスの形成に関わる因子を網羅的に同定することで、細胞外マトリックスの構造とシナプス形成の関係を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
平成２７年度の研究で、Haspと相互作用する因子を免疫沈降により同定しようと試みたが、現在得られている予備的な結果からは、当初の予想よりも解析対象が多くなる可能性が考えられた。そのため、これらの解析を効率よく進めるためには、トランスジェニック系統の作成、抗体作成などの受託研究を複数行う必要がある。そのため平成２７年度の未使用残額をこれらに当てるための繰越申請を行う。また、研究代表者は平成２８年度から東邦大学へ移動する。これまでの研究を円滑に進めるために、京都産業大学におけるこれまでの研究資産や研究環境を必要とするケースがあり、この共同研究旅費のためにもまた繰越金を当てる予定である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新規Hasp相互作用因子の解析のために、抗体作成やトランスジェニック系統作成のための受託研究費に使用する。また、平成２８年度から研究環境が移動により変わるため、必要機器の購入や、共同研究のための旅費などに使用する予定である。
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