2015 Fiscal Year Research-status Report
初期発生胚をモデルとした細胞内膜ダイナミクスによるシグナル伝達制御機構の解明
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15K21494
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| Research Institution | Doshisha Women's College of Liberal Arts |
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Principal Investigator |
川村 暢幸 同志社女子大学, 薬学部, 助教 (30411086)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 初期胚発生 / エンドサイトーシス / ミクロオートファジー / シグナル伝達 / 膜動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類初期胚では、様々なシグナルによりダイナミックに細胞分化・器官形成が行われている。また、胎盤が形成される以前の時期において、母胎からの栄養吸収に重要な臓側内胚葉（Visceral endoderm）とよばれる細胞グループでは極めて活発にエンドサイトーシスが起きており、活発な膜動態が観察され、我々は臓側内胚葉で特にミクロオートファジーというユニークな膜動態が起こっていることを報告した。エンドサイトーシス経路は、特に初期エンドソームが細胞内メディエーターにシグナルを伝える場として重要であることが指摘されている。本研究では、哺乳類初期胚を用いてエンドサイトーシス経路の膜動態（特にミクロオートファジーに着目して）によるシグナル伝達制御の役割の解明を目指す。
１．rab7、VPS16遺伝子欠損マウス共に、初期胚細胞における細胞内オルガネラの構造解析、形態形成に関与するシグナル伝達関連遺伝子の発現解析等を行った。rab7欠損胚では中胚葉形成に抑制がかかり胚発生が停止すること、胚葉の前後軸を決定する因子の発現量に差が見られることを見いだした。
２．rab7、VPS16遺伝子欠損細胞の樹立を行い、アデノウィルスによりCreリコンビナーゼを導入する方法により、当該タンパク質が消失することをイムノブロット法により確認できた。rab7遺伝子欠損細胞ついては、細胞内オルガネラの構造観察を行い、Lamp2陽性コンパートメントの凝集と増加がおこることを見いだした。また、シグナル伝達経路の動作確認を行ったが有意な差は見いだされなかった。
３．膜ダイナミクス関連因子の遺伝子ノックアウトマウス作出については、着手しなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
rab7遺伝子欠損マウス胚の解析において、今年度に予定した解析についてはおおむね終了できた。タンパク質レベルで形態形成シグナルであるlefty-1やcerlといった遺伝子についてその発現解析を中心的に行っているが、一回に得られる遺伝子欠損胚子の数が少ないこと、良好な抗体の選定や染色条件の設定に時間を要した。
VPS16遺伝子欠損マウス、細胞の解析については、今年度に予定した解析については、おおむね進行できているが、タンパク質レベルでVPS16の存在を示す為に必要な抗VPS16抗体が、市販品では特異的で良好な結果が得られる物がなく、自家での作製・精製を試みており、時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度については、おおむね順調に進行したが、一部、遺伝子欠損マウスの繁殖状況等により進行に時間を要している為、平成28年度はマウス維持数の増量も考慮しつつ研究を行っていく。
rab7遺伝子欠損マウスについては、使用する抗体の選定、条件設定等がほぼ終了したため、遺伝子欠損マウスの繁殖を待ち、順次、胚子を得て、実験を進めていく。得られる知見から、特に、前後軸決定因子の発現、細胞内外輸送経路等について解析していく。
VPS16遺伝子欠損マウスについては、今年度も引き続き抗VPS16抗体の作製に取り組んでいくが、動物の免役、その後の抗体精製を考えると、時間を要すると思われる。当研究室での先行研究から、胚子の免疫染色条件については、ある程度方向性と方法がルーティン化できている部分があるため、平行して胚の免疫染色等は進めていく。得られた知見から、まずは、VPS16遺伝子欠損マウスの異常箇所を解析していき、その異常箇所により、その後の解析方針を決めていく。
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| Causes of Carryover |
マウスの交配、抗体の選定、条件検討に時間を要したため、本格的な解析を始める前の段階であり、試薬使用量が当初の予定より少なかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
条件検討が終了し、これから、試薬容量が増加していくものと思われ、マウス維持数の増量等を考慮しており、いずれへも資金の重点的な使用を予定している。
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