2015 Fiscal Year Research-status Report
シアノバクテリア時計蛋白質KaiC複合体による細胞内時計の安定性制御の解析
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15K21523
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
岡野 圭子 (今井圭子) 関西医科大学, 医学部, 助教 (90454610)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | シアノバクテリア / 概日時計 / プロテオーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
概日時計とは、地球の自転に伴う環境変化に適応するため、地球上のほとんどすべての生物が獲得している生命現象である。概日リズム研究のモデル生物であるシアノバクテリアでは、遺伝学的解析から概日時計を構成する三つの必須時計遺伝子kaiA, kaiB, kaiCが同定されている。さらに、３つの時計蛋白質KaiA,KaiB,KaiCの混合により、in vitroで概日振動が再構築され、この化学的振動が時計の中核であることが示されている。しかし、細胞分裂や代謝などの外乱にさらされた細胞内での正確な24時間振動の維持機構は明らかでない。細胞内でKaiC量は概日振動し、KaiA,KaiBを含む巨大複合体を形成する。この複合体サイズは時間依存的に変化し、複合体サイズから未知の因子を含む事が示唆されているが、形成する因子の全容は明らかでない。本研究で、時間依存的な構成因子とそれに伴う機能変化を明らかにする事を目的にしてKaiC複合体のプロテオーム解析を行なった。
これまでに、主観的昼と主観的夜のKaiC複合体にそれぞれ含まれる蛋白質の候補をLC―MS/MSを用いた質量分析により検出した。また、転写活性における複合体の役割を明らかにするため、転写活性がほとんどない連続暗条件下でもKaiC複合体の構成因子の概日変化についての比較解析も行った。それぞれの時間に特異的にKaiCと結合している因子候補について注目し、１1の候補遺伝子の遺伝子破壊株作成を試み、リズムへの影響を確認することとした。３つの遺伝子については形質転換体が得られたが、シアノバクテリアの概日時計への影響は見られなかった。また、既に長周期化することがわかっているプロテアーゼClpP1もKaiC複合体の構成因子の候補として得られた。時間依存的なKaiCの分解を制御する因子の可能性があり、今後KaiCとの結合などの解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在までに、KaiCの複合体の構成因子候補を同定するための、LC―MS/MSを用いた質量分析によるプロテオーム解析は、ほぼ終了している。主観的夜（連続明16時間）、主観的昼（連続明4時間）、連続暗条件下（連続暗4時間、連続暗16時間）のそれぞれのシアノバクテリアの細胞抽出液から、KaiC蛋白質と結合している因子をaffinity精製し、その後プロテオーム解析をした。それぞれの条件で結合している可能性のある因子が得られ、各条件で特異的に強く結合している因子を優先的に解析する事を試みている。既に結合する事が示されている時計関連遺伝子の結合は確認されており、プロテオーム解析データの信頼性は高いと考えられる。候補遺伝子の変異体を網羅的に作成し、リズムの測定を行うことを計画しているが、精製過程でのバックグランドが完全に排除できず、候補因子の効率的な選抜が出来ていない。また、必須遺伝子の為か遺伝子破壊株が作成できない、作成できてもリズムに異常がみられない等の理由により、候補因子の絞り込みは、まだうまくいっていない。
KaiCの分解に関与する候補因子として解析を進めているClpプロテアーゼについては、in vitroでの相互作用の確認を試みるため、大腸菌内での発現を行っている。しかし、Clpプロテアーゼ群が大腸菌内でも重要な働きをするATPプロテアーゼであることからか、His―タグ用のプラスミド（pET-15）でうまく発現出来なかった。これについては、他のプラスミドでの発現を試みる予定である。
なお、出産のため産前産後、育児休暇（8月26日～1月11日）を取得しており、研究が中断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
LC-MS/MSの結果から、KaiCに結合する新規因子の候補がいくつか得られた。次年度以降、候補因子の中からKaiCと実際に結合し、シアノバクテリアの概日時計に影響を与える因子を同定し、その機能解析をする。プロテオーム解析の結果から、時間依存的な相互作用の変化、光条件依存的な相互作用の変化など、顕著な違いがみられたタンパク質について、優先的に解析を行う予定である。
シアノバクテリアでの候補因子の遺伝子破壊株を作成し、自動発光測定装置で効率よくリズムへの影響を確認する。破壊株が作成できない可能性もあるため、過剰発現株の作成も検討する。同時に、実際にKaiCタンパク質や時計関連タンパク質とそれらの候補タンパク質が結合しているのかを、in vitro、in vivoの免疫沈降により確認する。
KaiCの分解に関与が予想される因子の機能解析を行い、分解制御との関連性を明らかにする。Clpプロテアーゼ群については、既にリズムへの影響が確認されており、in vitroでのKaiCや他の時計関連タンパク質との相互作用の確認を優先して行う。
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| Causes of Carryover |
産前産後、育児休暇（8月26日～1月11日）を取得しており、研究が中断した。そのため、計画していた研究、学会発表が予定通りに行えず次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
自動測定環境を整えるために光照度を調節可能なLED照明装置を新たに購入することを計画している。タンパク質の相互作用の確認のため、抗体や精製用のカラムなどの消耗品の購入、また、試薬、培地、プラスチック器具などの消耗品も購入も計画している。これらを用いて効率的に研究を推進し、その成果を時間生物学会、植物生理学会での学会発表を行う予定である。
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