2015 Fiscal Year Research-status Report
BCRシグナルとTNFAIP3/A20遺伝子変異の関係
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15K21647
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
野本 順子 国立研究開発法人国立がん研究センター, 中央病院, 研究員 (30601322)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | TNFAIP3/A20 / NF-kB / BCRシグナル / ABC-DLBCL / 次世代シークエンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
B細胞受容体（B-cell receptor; BCR）シグナル経路の阻害剤は、B細胞リンパ腫に高い治療効果が期待されその有効性も認められているが、BCRシグナル経路下流に位置する遺伝子に異常があるActivated B-cell-like (ABC) typeびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（Diffuse large B-cell lymphoma; DLBCL）（ABC-DLBCL）では治療効果がみられないことがわかってきた。このことは、より下流のNF-κBシグナル経路に関連した遺伝子変異を有する場合には有効でない可能性が示唆される。申請者らはこれまでに、B細胞リンパ腫においてNF-κBの抑制因子である TNFAIP3/A20遺伝子（以下A20）の異常が高頻度に起こっていることを明らかにしてきた。
本研究ではABC-DLBCLを対象とし、BCRおよびNF-κBシグナル経路の各因子、特にA20とこれに連関した遺伝子の変異による BCRシグナル経路阻害剤への影響を検討するため、A20を含めた BCRおよびNF-κBシグナル経路に関係する遺伝子のターゲットリシークエンスによる次世代シークエンサー（NGS）解析から、ABC-DLBCLの疾患特異的な遺伝子変異とその頻度を調べる。ターゲットリシークエンス用プライマーパネルには関連する26遺伝子を設計している。また、A20と候補遺伝子が、BCRシグナル経路阻害剤の有効性に影響を及ぼすかをin vitroでの発現解析で確認する。
本研究によりABC-DLBCLの治療効果の向上と、新たな病型診断・治療選択・予後予測といった個別化診断の基盤づくりに繋がると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NGSパネルにはA20, BTK, MYD88, CARD11を含めたBCRシグナル経路下流の26遺伝子に加え、B細胞リンパ腫に関連する38遺伝子を新たに選択し64遺伝子の全エクソンをターゲットとして設計および作製した。
シークエンシングにはLife technology社のIon Torrent PGMシステムを使用して、作製したパネルの評価を行った。評価のためのランには、FFPE検体、凍結組織検体、細胞株を用いて、サンプル調整の条件、各遺伝子のカバー領域、および1ランあたりのリード数などを確認した。FFPE検体の場合、DNAの質と量でサンプル調整の条件を変更する必要があった。このことから、対象の検体として凍結組織検体あるいは骨髄検体を優先とした。既に対象としていたABC-DLBCL 41症例はFFPE検体が多く針生検など非常に小さな検体も含まれるため、NGS解析に対応出来る症例を新たに収集することとし、ABC-DLBCL 16症例の凍結組織検体および骨髄検体が収集できた。またデータ解析において、腫瘍部と非腫瘍部の差を求めることが重要であるが、全患者毎の非腫瘍部のコントロールを収集することが困難であったため、収集できた非腫瘍部のデータをコントロールとして使用することとした。カバーする遺伝子数と収集した検体数や検体の種類からNGSランニングのコストパフォーマンスを検討し、シークエンシングにはIon Torrent Protonシステムを採用することとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
検体は凍結組織検体あるいは骨髄検体とFFPE検体に分けそれぞれの条件でサンプル調整を行い、20～25検体単位でIon Torrent ProtonシステムによるNGSのランニングをする。収集できた非腫瘍部の解析データを正常コントロールとし、解析にはCLC Genomics Workbenchを使用する。ABC-DLBCLの疾患特異的な候補遺伝子を抽出しその頻度を求めるため、遺伝統計学的解析を行う。各患者の臨床背景因子を用いて疾患関連変異の同定と疾患関連解析による頻度の算出を行い、ABC-DLBCLにおける疾患関連遺伝子としての有用性を検討する。また A20との連関を検討するため、A20と候補遺伝子が単独で存在する場合と共存する場合で関連解析を行い、両者の疾患特異的な連関を統計学的に算出する。
つぎに、A20および候補遺伝子変異のBCRシグナル経路阻害剤への影響の検討するため、A20と候補遺伝子の異常がBCRシグナル経路阻害剤の一つであるIbrutinibの有効性に影響を及ぼすかを、細胞株を用いたin vitroでの発現解析を行う。A20を含む候補遺伝子を単独あるいは複数で細胞株へ導入し、発現株や欠損株を作成する。これらのコンストラクトの細胞株を用いて、Ibrutinibの暴露を行う。MTTアッセイ法および定量PCR法により薬剤感受性を検討し、A20や候補遺伝子の異常によるIbrutinib耐性の有無を確認する。
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| Causes of Carryover |
当該年度内での検体収集が予定数に満たなかったため、次世代シークエンスの試薬購入が次年度に必要となった。
次世代シークエンス解析によるデーター算出が遅れており、学会発表は次年度に行うこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
費用のほとんどが次世代シークエンス用試薬であり、予定症例数がそろい次第次世代シークエンスランニングのための試薬購入に使用する。他試薬費用は、細胞培養、遺伝子組換え、発現解析などの in vitro 実験試薬の購入に使用する予定である。
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[Journal Article] FUS-ERG gene fusion in isolated myeloid sarcoma showing uncommon clinical features.2016
Author(s)
Ueda R, Maruyama D, Nomoto J, Maeshima AM, Fukuhara S, Kitahara H, Miyamoto K, Munakata W, Suzuki T, Taniguchi H, Kobayashi Y, Tobinai K.
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Journal Title
Oxf Med Case Reports.
Volume: 1
Pages: 4-8
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Clinicopathological features of classical Hodgkin lymphoma in patients ≧ 40 years old, with special reference to composite cases.2015
Author(s)
Maeshima AM, Taniguchi H, Nomoto J, Makita S, Kitahara H, Fukuhara S, Munakata W, Suzuki T, Maruyama D, Kobayashi Y, Tobinai K.
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Journal Title
Jpn J Clin Oncol.
Volume: 45
Pages: 921-8
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Intravascular large B-cell lymphoma secondary to lymphoplasmacytic lymphoma: a case report and review of literature with clonality analysis.2015
Author(s)
Tanaka Y, Kobayashi Y, Maeshima AM, Oh SY, Nomoto J, Fukuhara S, Kitahara H, Munakata W, Suzuki T, Maruyama D, Tobinai K.
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Journal Title
Int J Clin Exp Pathol.
Volume: 8
Pages: 3339-43
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Akihisa Kawajiri, Dai Maruyama, Akiko Miyagi Maeshima, Junko Nomoto, Shin-ichi Makita, Hideaki Kitahara, Ken-ichi Miyamoto, Suguru Fukuhara, Tatsuya Suzuki, Wataru Munakata, Kinuko Tajima, Jun Itami, Hirokazu Taniguchi, Yukio Kobayashi, Kensei Tobinai.2015
