BCRシグナルとTNFAIP3/A20遺伝子変異の関係

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K21647
• Research Institution: National Cancer Center Japan
• Principal Investigator: 野本 順子 国立研究開発法人国立がん研究センター, 中央病院, 研究員 (30601322)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: TNFAIP3/A20 / BCRシグナル経路 / ABC-DLBCL / イブルチニブ

Outline of Annual Research Achievements

BCRシグナル経路阻害剤であるイブルチニブはBCRシグナル因子であるブルトン型チロシンキナーゼ(BTK)を阻害し、B 細胞リンパ腫に有効性が認められている。しかし、BTKより下流に位置する遺伝子に異常がある ABCタイプびまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫(ABC-DLBCL)では治療効果がみられないことがわかってきた。このことは、より下流の NF-κB シグナル経路に関連した遺伝子変異を有する場合にはイブルチニブが有効でない可能性が示唆される。申請者らはこれまでに、NF-κB シグナル経路上のTNFAIP3/A20遺伝子(以下 A20)の異常が、B 細胞リンパ腫 において高頻度に起こっていることを明らかにしてきた。本研究では、ABC-DLBCLにおいて A20を含むNF-κBシグナル経路に関連する遺伝子変異がイブルチニブの有効性に与える影響を明らかにするため、次世代シーケンシング(NGS)により疾患特異的な遺伝子変異を見つけ、それらの変異型細胞株の薬効試験を行う計画である。
NGSは、A20, BTK, MYD88, CARD11といったBCRシグナル経路下流の遺伝子とB細胞リンパ腫に関連する遺伝子から64遺伝子を選択し、これらの全エクソンについてターゲットシーケンスを行った。CLC Genomics Workbenchソフトウェアを使用して変異解析行い、ABC-DLBCLの疾患特異的な遺伝子異常を抽出した。更に、Biomedical Genomics Workbenchソフトウェアを用いて再解析を行い、変異解析およびコピー数多型解析からA20を含むBCRシグナル経路下流の遺伝子異常と連関する遺伝子異常を抽出した。
今後は、A20 を含むBCRシグナル経路下流の遺伝子異常が、イブルチニブの有効性に影響を及ぼすかをin vitroでの薬剤感受性試験で確認する。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

BCRシグナル経路下流因子およびB細胞リンパ腫に関連した64遺伝子の全エクソンをターゲットとしたNGSパネルを設計・作製した。パネルの評価および検体DNAの品質評価を行い、NGS解析が可能なABC-DLBCL 患者68症例を対象にサーモフィッシャー製Ion Torrent Protonシステムを用いたターゲットシーケンスを行った。1ラン当りのリード数は約106 で、1検体当りのリード数は平均4.2 Mだった。
データ解析において、非腫瘍部コントロールについては、収集できた30症例のデータをプールして使用した。解析にはキアゲン社製CLC Genomics Workbenchおよびサーモフィッシャー製IonReporterソフトウェアを使用し、変異解析およびコピー数多型(CNV)解析よる欠失/挿入の確認を行い、既報のMYD88やCARD11以外にも高頻度に見られる遺伝子異常が見つかった。更に、ターゲットシークエンスでもCNV解析が可能なキアゲン社製Biomedical Genomics Workbenchソフトウェアによる再解析から、A20を含むBCRシグナル経路下流の遺伝子異常と連関する遺伝子異常を抽出した。
続いて変異型細胞株の薬効試験を行う計画であるが、平成29年度夏期から当機関研究所の移設と、利用している細胞培養室の整備が行われたため、細胞実験が行えなかった。重ねて、平成29年度初めに研究指導者の所属機関移動と人員の減少があり、新たな組織体制の元で臨床関連の他業務が多忙となり、研究が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

NGSデータ解析により抽出したABC-DLBCLに特異的な異常を持つ遺伝子やA20の遺伝子変異が、イルブチニブの有効性に及ぼす影響の検討するため、細胞株を用いた薬剤感受性試験を行う。A20 を含む候補遺伝子に変異を持つ発現ベクターを作製し、各候補遺伝子単独あるいは候補遺伝子同士を組み合わせて導入した変異細胞株を作製する。また発現誘導システムあるいはsiRNAにより候補遺伝子を欠損した細胞株の作製も試みる。作製したコンストラクトの細胞株へイブルチニブの暴露を行い、細胞増殖能に及ぼす影響をMTTアッセイ法および定量PCR法により評価する。薬剤感受性の評価からA20と候補遺伝子の単独および組み合わせによるイブルチニブの有効性への影響を確認する。
A 20や候補遺伝子がABC-DLBCLの治療選択に有用なバイオマーカーとなり得る場合は、これらの遺伝子異常の検査・診断法の検討を行う。

Causes of Carryover

（理由）平成29年度夏期から当機関研究所の移設に伴い利用しているシークエンサーや細胞培養室の利用ができなかったため、シーケンスやデータ解析の遂行に予定よりも時間を要し、続く細胞実験が行えなかった。重ねて、本年度は研究指導者の所属機関移動と人員の減少があり、新たな組織体制の元で臨床関連の他業務が多忙となったため、研究が遅延した。

（使用計画）多くの経費は、細胞株による薬剤感受性試験およびデータ解析に必要なソフトウェアの費用として使用する。また、研究成果をしかるべき学会、学術誌に発表するための諸経費を計上する。