Mechanisms of DNA repair involved in the genome editing efficiencies in mouse zygotes

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K21654
• Research Institution: National Center for Child Health and Development
• Principal Investigator: 原 聡史 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 研究員 (80739582)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

CRISPR/Cas9によるゲノム編集技術は目覚ましい速度で進歩しているが、Cas9によるDNA二重鎖切断後の相同組換え（HDR）によるDNA修復を利用し、一本鎖オリゴ（ssOligo）を介して外来配列を挿入する効率は未だに高いとはいえない。本年度は、マイクロインジェクションを行うタイミングと受精卵の細胞周期との関連性を明らかにするために、異なる前核期（受精後3時間（PN1-2）、6時間（PN3-4）および10時間（PN4-5））の受精卵にsgRNA/Cas9/ssOligoをインジェクションし、胚移植後得られた仔の遺伝子型を解析することで、外来配列（loxP）が挿入される効率を求めた。その結果、受精後10時間経過した受精卵（PN4-5）にインジェクションした場合において、in vivoに由来する受精卵と同程度の効率でloxPの挿入が認められた。一方で、それ以前にインジェクションした実験区においては10時間経過した受精卵を用いた区に比べて有意にloxPの挿入効率が低く、胚盤胞における結果と概ね一致する結果であった。以上のことから、HDRは体細胞と同様の機構で行われることが確かめられた。またルシフェラーゼアッセイを用いたスクリーニングの構築について、ウィルスベクターを用いた系では当初デザインした通りではワークしなかったことから、SSAアッセイに用いるベクターを一過性発現する系を採用した。NHEJに関与するDNA-PKCsの阻害剤であるNU7026を用いてHDR効率が向上するか否かを検討したところ、実際にルシフェラーゼ活性が上昇することが明らかになったことから、スクリーニング系を構築できたと判断された。