2017 Fiscal Year Annual Research Report
Whole genome manipulation for understanding of biology of unculturable bacteria(Fostering Joint International Research)
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15KK0266
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
柿澤 茂行 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10588669)
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| Project Period (FY) |
2016 – 2017
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| Keywords | 細菌 / ゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本国際共同研究では、全ゲノムクローニングの技術をベースとして、その技術を発展させることで難培養細菌の機能解析を行うことを目的とする。培養できるマイコプラズマのゲノムに他の細菌のゲノムを付加することで、大規模なゲノムのハンドリング技術を確立すると共に、各細菌の持つ機能を解析する技術の確立を目指す。難培養細菌ゲノムを操作・導入する系について、本研究では独自に複製可能なプラスミドを用い、ここに対象となる細菌のゲノムを挿入する系を新たに用いた。これにより、巨大なゲノム断片をより簡便にハンドリングできるとともに、扱うゲノム全体のサイズを小さくすることが可能となるため、ゲノムの物理的な断片化等のリスクを軽減させ、効率的にゲノム断片を扱うことが可能となる。まずはこのプラスミドについての性状および導入法を検討し、効率よく導入できる方法を確立した。次にここに各種のDNA断片を挿入し、それが複製可能であることを確認した。加えて本国際共同研究では、酵母内においてYAC（酵母人工染色体）ベクター内の配列を自在に操作（挿入や欠失、変異など）する技術を確立・習得した。具体的には、Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) 法や、Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC) 法、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Cas9（CRISPR-Cas9）などの手法を用いることで、より簡便に酵母内のインサート配列を改変することが可能であった。
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