2015 Fiscal Year Research-status Report
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15KT0152
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
池ノ内 順一 九州大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (10500051)
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| Project Period (FY) |
2015-07-10 – 2018-03-31
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| Keywords | リポソーム / 細胞膜脂質 / PI(4,5)P2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜を構成する脂質分子種は多様であり、それらの分布や機能については不明な点が多い。これまで脂質分子種の機能解析には、脂質代謝酵素をノックアウトしてその表現型を解析する手法が広く利用されてきた。しかしながら、脂質代謝酵素の消失は、脂質代謝に広範な影響を及ぼすため、特定の脂質分子種の機能解析に適していない。そこで本研究課題に於いて、私は特定の脂質分子種を含むリポソームを細胞内に導入し、その細胞応答を観察することにより、１種類の細胞膜脂質の機能を解析する方法論の確立を目指している。この方法を用いて、特定の脂質分子種を特異的に認識し結合するタンパク質の探索や、特定の脂質分子種を含むリポソームが細胞小器官へ経時的に発展する様子を観察したい。
今年度は形質膜に豊富に存在するPI(4,5)P2（ホスファチジルイノシトール-4,5-2リン酸）を含むリポソームを作出し、細胞内への導入方法の検討を行った。リポソームに蛍光ローダミン標識したホスファチジルエタノールアミンを少量混和して、細胞内へ導入されたか否かの指標として用いた。具体的に試みた方法としては、細胞内へのマイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび細胞外液の組成を変化させて浸透圧差を利用した細胞内導入法の3種類の導入方法である。今年度は、引き続き導入の条件検討を行う。またPI(4,5)P2は、ホスホリパーゼCのPHドメインなど特異的に結合するタンパク質ドメインが既に知られている。PI(4,5)P2を含むリポソームを細胞内に導入したときに、リポソームを認識してこれらの既知のタンパク質が実際に集積するか否かについても実験を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞内に導入するリポソームのサイズの検討および導入方法の検討を行った結果、細胞内に導入されたリポソームが観察できるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内に導入したローダミン標識した脂質分子を含む蛍光リポソームに、GFPを融合させたタンパク質が集積するか否かについて、ライブイメージングを用いて観察する。また現在の実験に用いているサイズのリポソームは長時間の細胞内での追跡が困難であることから、量子ドットなどをリポソームで被覆して細胞内へ導入する方法について検討を行う。
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| Causes of Carryover |
リポソームの作成に必要な脂質標品および蛍光標識脂質は、研究室に存在していた古いストックから利用したため、今年度の実験で計上していた物品費の支出が無かった。しかし今年度の使用で脂質標品のストックが枯渇してしまったので、次年度に物品費を使用する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に、今年度に計上していた物品費を執行する。
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