DNA修復酵素を用いた突然変異特異的クローニング法の確立

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16012257
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 塚本 俊彦 北里大学, 薬学部, 助教授 (10236862)
• Keywords: 大腸癌 / 突然変異

Research Abstract

1.研究の目的と進め方
塩基配列の差異をもとに網羅的に遺伝子をcloningすることが可能ならば、これを、病変と正常組織で行えばsomatic mutationが、また個体間で行えばポリモルフィズムを、発見、解析する強力な手法となり得ることが予測される。このような、"突然変異特異的クローニング法"の確立と、そのhigh-throughputな系への移行を目的として研究を行ってきた。まず、系の確立のために、塩基配列の変化が多いと予想される、DNA修復酵素の異常によるMicrosatellite Instability(MSI)陽性大腸癌を用いて、その正常組織と癌組織より作成したcDNA libraryをハイブリダイズさせ、heteroduplexを特異的に認識するDNA修復酵素を用いてpull downし、得られたクローンを解析した。
2.過去一年の成果
得られたクローン、用いたサンプルのcDNA、染色体DNAを解析した結果、3'UTRのmononucleotide repeatの変異を持つ複数の遺伝子と、coding領域に変異の存在する小数の遺伝子を単離することができた。さらにこの方法により、癌組織においてのみ、高率に塩基配列の変異が認められる新規遺伝子をクローニングすることができた。これは、癌細胞の増殖に関与することが知られている遺伝子のnatural antisense transcript(NAT)である可能性が高く、癌細胞における発現量と配列の変化を含め、現在publicationにむけて実験を進めている。