2004 Fiscal Year Annual Research Report
イオンチャネル・受容体群の「膜上直接的相互作用」によるシナプス伝達の調節機構
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16015238
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
久保 義弘 生理学研究所, 分子生理研究系, 教授 (80211887)
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| Keywords | ATP受容体 / P2X2 / チャネルポア / 発現密度 / アフリカツメガエル卵母細胞 / 動的構造変化 |
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| Research Abstract |
アフリカツメガエル卵母細胞にイオンチャネル型のATP受容体P2Xを発現させ、2本刺し膜電位固定下でATP投与後の電流を記録し、受容体の種々の性質を発現レベルとの関連において解析し以下の知見を得た。(1)チャネルポアのイオン選択性の指標であるP_<NMDG+>/P_<Na+>は発現密度と負の相関を示した。(2)内向き整流性の強弱は発現密度と負の相関を示した。(3)高濃度のATP(100uM)により弱い内向き整流性電流を呈する発現密度の高い細胞に、低濃度ATP(3uM)を投与するとその内向き整流性は増強した。(4)[ATP]-応答関係のKdの値は発現密度と負の相関を示した。(5)ポア上部の点変異1328Cにより上記の発現密度に依存したポアの性質の変化がほぼ消失した。以上の結果から「ATP投与により開状態に入った、ごく近傍にあるP2X_2受容体チャネル間の相互作用によりポア上部においてなんらかの構造変化が起こり、ポアの性質やリガンド感受性が変わる。」ことが想定された。
さらに、P2X2受容体チャネルのリガンド投与による動的構造変化を、FRET法によりリアルタイムで解析することを目的として、C末端に蛍光蛋白CFPもしくはYFPを付加したコンストラクトを作成し、全反射照明下で膜に発現している分子由来の蛍光のみを測光した。実験当初、リガンド投与によりFRET値が変化するというデータを得ていたが、その後の解析により、CFPおよびYFPの両者が減少することが明らかになった。すなわち、C端部分が、リガンド投与によって、全反射照明の強度の弱い膜から離れた部位にシフトする可能性が示唆された。この点について、さまざまな部分に蛍光蛋白を付加したコンストラクトを作成し、さらに解析を進めている。
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