2004 Fiscal Year Annual Research Report
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16084202
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
木村 宏 京都大学, 医学研究科, 研究員(科学技術振興)(常勤形態) (30241392)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大隅 圭太 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 助教授 (20221822)
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| Keywords | ヌクレオソーム / クロマチン / 細胞 / 膜透過化細胞 / 細胞核 / 細胞生物学 / 分子生物学 / ヒストン |
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| Research Abstract |
クロマチン構造構築の制御機構を明らかにするために,非イオン性界面活性剤処理により細胞膜を透過性にした細胞(膜透過化細胞)を用いて,生細胞で見られるヒストンのアセンブリ・分子交換を再構成する系を確立した.GFP融合ヒストンを発現する細胞から調製した細胞抽出液を膜透過化細胞に添加し,蛍光顕微鏡を用いて細胞抽出液中のGFP融合ヒストンが膜透過化細胞クロマチンへ取り込まれる様子を観察した.その結果,ヒストンH2AとH2BはDNA複製に依存せず真正クロマチンに取り込まれたが,ヒストンH3は主に複製したクロマチンに取り込まれ,生細胞で見られるヒストンの挙動と同様であった.また,精製したGFP融合H2A・H2B複合体を膜透過化細胞に添加しただけではその取り込みは見られなかったが,HeLa細胞由来の細胞抽出液を添加するとGFP融合H2A・H2B複合体の取り込みが回復した.そこで,細胞抽出液をクロマトグラフィーにより分画し,GFP融合H2A・H2B複合体の取り込みを補助する因子の精製を行った.ゲルろ過後の最終精製産物を電気泳動した結果,3本のバンドが検出され,質量分析によりそれぞれのタンパク質を同定した.さらに,これらのタンパク質を大腸菌で発現・精製し,膜透過化細胞におけるGFP融合H2A・H2B複合体の取り込み促進活性を測定した結果,それぞれ単独で活性を持つことが明らかになった.以上の結果より,今回構築した膜透過化細胞を用いるヒストンアセンブリ・交換系は,ヒストンダイナミクスの分子機構の解明に向けたブレイクスルーとなりうることが示された.現在,この系で同定されたタンパク質の生細胞内における役割をフォトブリーチング法により解析している.また,研究分担者は,アフリカツメガエル卵抽出液を用いたクロマチン再構成系を用いて異なるヒストンアセンブリ因子の役割を明らかにしている.
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