細菌細胞膜上のフェロモン受容体と輸送体の立体構造解析、構造に基づく新規抗菌薬設計

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16087203
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 永田 宏次 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (30280788)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中山 二郎 九州大学, 大学院・農学研究院, 助教授 (40217930)
• Keywords: quorum sensing / Enterococcus faecalis / histidine kinase / peptide pheromone / membrane protein / signal transduction / response regulator / two component system

Research Abstract

腸球菌Enterococcus faecalisの病因物質ゼラチナーゼの発現制御にかかわるペプチドフェロモンGBAPの生合成および輸送膜タンパク質FsrB、受容体膜タンパク質FsrC、および転写活性化因子FsrAについて、大腸菌Escherichia coliを宿主とする組換えタンパク質発現系を構築し、発現・精製・結晶化・X線結晶構造解析を進めている。
フェロモン受容体膜タンパク質FsrCを大腸菌Escherichia coliを宿主として発現させることに成功し、培地1リットルあたり0.3mgの精製FsrCを得た。その後、結晶化条件探索の結果、ポリエチレングリコールを沈殿剤として柱状の微結晶(10x10x60μm^3)が得られた。この結晶は、Spring-8 BL41XUで9.3Å分解能まで回折した。その後、結晶化条件の最適化を進めており、現在までに10x20x150μm^3の結晶が得られている。今後も、結晶化条件の最適化を最優先して進め、高分解能の回折データ取得を目指す。
研究分担者の中山二郎博士により合成されたGBAPを用いて、FsrCとGBAPの複合体についても結晶化実験を開始した。さて、FsrCの結晶化用試料の調製の際、精製FsrCを濃縮すると一部がSDS処理でも解離しない安定な2量体を形成することが明らかになった。γ-^<33>P-ATPを用いた自己リン酸化実験によりタンパク質に取り込まれた^<33>PはSDS-PAGEでFsrCの2量体に相当する位置に検出されたため、FsrCの自己リン酸化は、安定な2量体中、片方のサブユニットが他方のサブユニット中のヒスチジン側鎖をリン酸化することにより起こると推測している。

Research Products

• [Journal Article] Crystal Structure of the YjgF/YER057c/UK114 Family Protein from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii (2006)
  • Author(s): Miyakawa, T., (5名), Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Proteins 62 Pages: 557-561
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of PH1566, aputative ribosomal RNA processing factor from the hyperthermophilic archaemon Pyrococcus horikoshii OT3. (2006)
  • Author(s): Jia, M.Z., Ohtsuka, J., Lee, W.C., Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Acta Crystailographica Section F : Structural biology and Crystallization communications 62 Pages: 47-48
• [Journal Article] Crystal structure of monomeric sarcosine oxidase from Bacillus sp. NS-129 reveals multiple conformations at the active-site loop. (2005)
  • Author(s): Nagata, K.et al.(計11名)
  • Journal Title: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 Pages: 220-224
• [Journal Article] Crystal structure of the short-chain flavin reductase HpaC from Sulfolobus tokodaii strain 7. (2005)
  • Author(s): Okai, M., Kudo, N., Nagata, K., Lee, W.C., Kamo, M., Tanokura, M.
  • Journal Title: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 Pages: 229-232
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the YjgF/YER057c/UK114-family protein ST0811 from Sulfolobus tokodaii strain 7. (2005)
  • Author(s): Miyakawa, T., (5名), Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F : Structural Biology and Crystallization Communications 61 Pages: 828-830
• [Journal Article] Crystal structure of glutamine amidotransferase from Pyrococcus horikoshii OT3. (2005)
  • Author(s): Maruoka, S., Lee, W.C., Kamo, M., Kudo, N., Nagata, K., Tanokura, M.
  • Journal Title: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 Pages: 459-462