2005 Fiscal Year Annual Research Report
ヒトゲノム機能解析のためのsiRNAライブラリの構築とRNAi関連遺伝子の探索
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16201040
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
西郷 薫 東京大学, 大学院・理学系研究科, 教授 (50136454)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
程 久美子 東京大学, 大学院・理学系研究科, 科学技術振興特任助教授 (50213327)
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| Keywords | RNA interference / RNAi / siRNA / humna / mouse / 機能解析 / siRNAライブラリ / RNAi関連遺伝子 |
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| Research Abstract |
ゲノム科学研究の焦点は、その構造解析から機能解析へと移ってきた。RNAi法は迅速な網羅的遺伝子機能解析法として注目されている。本研究では、ヒトを含む哺乳類の遺伝子機能解析のためのRNAi関連技術を開発し、siRNAミニライブラリを構築してスクリーニングを行なう。既に哺乳類において、効率よくRNAiを誘導するsiRNA配列設計用のウエブサイトを公開している。DNA型RNAiでは予定したsiRNAが細胞内で形成できない場合がある。そこでまず、昨年度報告したpol IIIに代わるpol IIに基づいた条件発現ベクターを開発し、pol III転写物の3'末端のオリゴUのばらつきの効果、RNA startの塩基preference、およびコード領域のAあるいはUストレッチ効果を回避できるようにした。また、shRNAのDicerによる切断パターンの決定に関するRNA配列部位の存在を示した。次にoff-targetを最小にするための実験と関連して、2種のsiRNAを直列に繋いだ2本鎖RNAによるRNAi効果を検討した。その結果、dsRNAの3'末端から、Dicer分解に関してin-frameで効率的siRNA配列が存在していると長いdsRNAでも有効なRNAiがおこることやダブルノックダウンができることが分かった。さらに、マウスの転写因子に対するDNA型ミニsiRNAライブラリを用いて、Embryonic Stem (ES)細胞の分化誘導に関わる遺伝子のスクリーニングを行なった。分化マーカー遺伝子のプロモータ領域をルシフェラーゼ遺伝子に繋いだレポーター遺伝子を作製し、ノックダウンすると、レポーター活性を増加させる遺伝子を探索した。その結果、少なくとも2つの新規候補遺伝子が見いだされた。
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