2005 Fiscal Year Annual Research Report

酵素の光学選択性に関与する基質認識部位の網羅的解析

Research Project

Project/Area Number	16360411
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	中野秀雄名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00237348)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	岩崎雄吾名古屋大学, 生命農学研究科, 助教授 (50273214) 加藤且也独立行政法人)産業技術総合研究所中部センター, 主任研究員 (70356781)
Keywords	リパーゼ / 無細胞タンパク質合成系 / 一分子PCR / 光学選択性 / ハイスループットスクリーニン / エマルジョン / ファジーニューラルネットワーク
Research Abstract	本研究では安定性に優れ、工業的に有用な微生物リパーゼを構造の枠組みとして用い、その基質結合部位だけに組み合わせ変異を導入し、光学異性体基質によりスクリーニングすることで、様々な基質特異性、反応性を有するリパーゼ群を創製し、基質認識部位の構造と反応性について網羅的に解析することを目的としている。以下に本年度の主たる成果を記す。 1)Burkholderia cepacia KWI-56リパーゼのSIMPLEXライブラリーと基質(p-nitrophenyl(R,S)3-phenylbutyric acid)との1一次スクリーニングデータを用いて、ファジーニューラルネットワーク(FNN)により解析し,基質の光学選択性とアミノ酸変異に関して一定のルールを導きだした。さらに構築したFNNルールに従い、新たな変異体を作製し、得られたルールが妥当であることを証明した。このことは、ハイスループットスクリーニングとFNNの組み合わせは非常に効果的であることを示唆している。 2)SIMPLEX法をより効率化するため,エマルジョン中でDNA一分子をビーズ上に固定増幅させる技術を確立した。これを用いて作製したビーズ上でのリパーゼの変異ライブラリーを用い、384穴プレートによる一ビーズPCRを行い、DNAライブラリーを作製した。次に無細胞タンパク質合成系により変異リパーゼをプレート上に発現させ、上記基質によりスクリーニングを行った。その結果、野生型より約20倍活性の上昇した変異体を得ることに成功した。