エンドヌクレアーゼの標的DNA認識に関する構造生物学的解析と基質特異性改変

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16380061
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 喜多 恵子 京都大学, 農学研究科, 教授 (70234226)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 左子 芳彦 京都大学, 農学研究科, 教授 (60153970) ; 津下 英明 徳島文理大学, 健康科学研究所, 教授 (40299342)
• Keywords: 制限修飾系 / 制限酵素 / エンドヌクレアーゼ / 結晶化 / 部位特異的変異 / 金属イオン / 界面活性剤

Research Abstract

大腸菌TH38株由来の制限酵素EcoT38Iについて、昨年度構築した大量発現系から均一な標品が得られたので、市販の結晶化試薬を用いて結晶化条件の検討を行った。約150種類の試薬を用いて、ハンギングドロップ法により5℃と20℃、基質DNA存在下と非存在下で結晶化を試みた結果、数種類の結晶が得られた。SPring-8 BL41XUビームラインを用いてデータ収集を試みたが、回折データは得られなかった。大量発現にあたり、組換え体大腸菌を植え継ぐことによって、酵素の発現量が著しく低下することを明らかにした。均一に精製した酵素標品を用いて酵素学的諸性質を解析した結果、本酵素はMnイオン存在下でもMgイオン存在下の約30%の活性を示し、Coイオン存在下でもわずかな活性を示すことを明らかにした。一方、すでに立体構造を明らかにしている大腸菌H709c株由来の制限酵素EcoO109Iについて、認識配列の改変を目指してK74とK173の部位特異的変異酵素を構築して解析を行った。K173R変異酵素は触媒活性を消失したが、予想に反してK74R変異酵素の比活性は野生型の約10倍まで上昇した。4種類の配列に対する切断活性のプリファレンスを比較した結果、野生型ではほとんど差がなかったのに対し、K74R変異酵素では2-3倍の差が認められた。さらに、反応液に非イオン性界面活性剤Triton X-100を添加することで、反応速度が約100倍上昇することを見出した。