2005 Fiscal Year Annual Research Report

甲殻類のメラニン生成に関わる新経路の解明とその阻害による黒変防止

Research Project

Project/Area Number	16380144
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	平田孝京都大学, 農学研究科, 教授 (40273495)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	菅原達也京都大学, 農学研究科, 助教授 (70378818) 木下政人京都大学, 農学研究科, 助手 (60263125) 伊藤祥輔藤田保健衛生大学, 衛生学部, 教授 (70121431) 若松一雅藤田保健衛生大学, 衛生学部, 教授 (80131259)
Keywords	甲殻類 / メラニン / ヘモシアニン / クルマエビ / クチクラ / 黒変 / 冷凍エビ
Research Abstract	本研究の目的は、甲殻類の凍結解凍後におけるメラニンの真の生成機構を明らかにし、その新規な防止法を開発することである。我々はすでにクルマエビを試料として真の黒変因子はヘモシアニン(Hc)であることを明らかにしている。しかし、(1)Hcはエビの体のどこで活性化し、メラニン生成を引き起こしているのか、(2)Hcは何を基質としてどのような構造のメラニンが生成しているか、(3)Hcの活性化因子は何か、などについては依然として未知のままであり、その解明をおこなう。昨年度は(2)について、クチクラでの活性を評価したが、今年度は血リンパにおける基質特異性を評価した。すなわち、クルマエビ血リンパからHcを精製した。精製HcをNative-PAGEし、SDS溶液によりPO様酵素に活性化処理後、各フェノール性基質溶液を添加し、反応中間体ドーパキノンをバンドとしで検出しで活性を評価した。また、96穴プレート上で精製Hc、Hc活性化因子、上記の各基質溶液を混合し、ドーパクロム(475nm)の吸光度を測定することによる活性評価も行った。その結果、活性染色では、DOPAだけでなく、チロシン、チラミン溶液でもドーパキノンのバンドが検出された、また、96穴プレートを用いた反応でも、上記の各種基質溶液全てでドーパクロム生成が見られたことからHcはジフェノールオキシダーゼ活性だけでなくモノフェノールオキシダーゼ活性も有するということが明らかとなった。また、基質酸化反応を経時的に計測した結果、チロシン酸化反応では、DOPA酸化反応とは異なり誘導期が存在し、基質酸化反応が全体として遅くなるということが明らかとなった。このことにより、エビ類Hcのモノフェノール酸化活性がこれまで見過ごされてきたと考えられる。また、同様のモノフェノールオキシダーゼ活性はオーストラリアロブスターのヘモシアニンにおいても認められた。